王璽，李彬春，張晟，謝斌，吳長新，李深偉，孟慶來*

（1.山西大學 生物醫(yī)學研究院，山西 太原 030006；2.山西大學 生物技術研究所，山西 太原 030006；3.隆德大學 純應用生物化學系，瑞典 隆德 SE-22100；4.上海國際旅行衛(wèi)生保健中心，上海 200335）

0 引言

新德里金屬-β-內酰胺酶1（NDM-1）是一種金屬-β-內酰胺酶（MBL），可水解幾乎所有β-內酰胺類抗生素（包括碳青霉烯類）以及絲氨酸β-內酰胺酶抑制劑[1]。NDM-1從肺炎克雷伯菌分離株中發(fā)現后其編碼基因blaNDM-1在世界范圍內迅速傳播，主要出現在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等條件致病菌中[2]。隨著blaNDM-1基因不斷進化，目前已出現近20種變體。伴隨著進化這些變體的熱穩(wěn)定性和鋅離子結合力逐步提高，以應對環(huán)境壓力和宿主營養(yǎng)免疫[3-4]。由于NDM-1常與其他β-內酰胺酶及其他抗生素抗性相關因子在病原菌中共表達，因此表達NDM-1的病原菌幾乎對目前所有臨床可用的抗生素具有抗性，導致感染發(fā)病率和死亡率的升高[5-6]。因此，產NDM-1的菌株已成為全球主要健康威脅菌之一。

氨曲南（ATM）是一種單環(huán)β-內酰胺類抗生素，對MBL具有穩(wěn)定性，但可被Ambler分類中的一些A類和C類廣譜β內酰胺酶水解[7]。氨曲南是一種主要用于治療由革蘭氏陰性菌如假單胞菌引起感染的抗生素，其殺菌機制主要通過與青霉素結合蛋白3結合從而抑制細菌壁生成，最終導致細菌死亡。近年來，聯合應用ATM與頭孢他啶（CZA）-阿維巴坦治療產MBL的多重耐藥腸桿菌在體外殺菌實驗和體內臨床治療都取得了較好的效果[8]，該治療策略的作用機制為由于氨曲南對MBL穩(wěn)定，在阿維巴坦（絲氨酸酶抑制劑）的保護作用下氨曲南可對同時產超廣譜β內酰胺酶（ESBL）和MBL的腸桿菌進行殺傷[9-11]。然而目前尚不清楚氨曲南是否可通過與MBL結合而抑制MBL對頭孢他啶的水解，從而增強頭孢他啶殺菌活性。本研究以NDM-1為模型，分析在氨曲南存在的情況下，MBL水解其他β內酰胺類抗生素的活性[12-13]。

1 材料和方法

1.1 材料

美羅培南三水標準品購自國家食品藥品監(jiān)督管理局，青霉素G和氨曲南購自北京索萊寶科技有限公司，頭孢硝噻吩購自Sigma公司（美國）。本研究中使用的所有抗生素的純度均高于98%。由Steinachglas公司（施泰納赫，德國）獲得直徑為125μm～140 μm且孔徑為50 nm的丙氨基衍生的可控孔玻璃珠（CPG），化學試劑購自北京索萊寶科技有限公司或上海生工公司，分子生物學酶購自Takara Bio，blaNDM-1及其引物由上海生工合成。

1.2 蛋白表達和純化

NDM-1的表達和純化除了不去除重組蛋白N末端的His標簽[14]，其余步驟與前期發(fā)表的文章相同[15]。blaNDM-1全長模板合成于上海生工。隨后，用一對引物（上游引物：5’GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGTGAAATCCGCCCG ACG 3’；下游引物：5’CAGTGGTGG TGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGCGCAGCTTGTCGG C 3’）通過PCR從全長blaNDM-1重組蛋白的N末端去除第1-28個氨基酸殘基對應的核苷酸序列并在截短的blaNDM-1核苷酸序列中引入6個His標簽核苷酸序列，然后將擴增產物插入pET-28a載體。具有N-末端標簽的重組蛋白質在大腸桿菌菌株BL21（DE3）中于 22℃在異丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）的誘導下產生。收集細菌并超聲裂解菌體，收集上清。立即將上清液上樣到Ni2+-NTA色譜柱（Qiagen）上，然后用40 mmol/L咪唑柱洗滌，用200 mmol/L咪唑洗脫。洗脫的NDM-1在4℃下用磷酸鹽緩沖液透析兩次。對于純化的NDM-1，通過SDS-PAGE測定表達和純度，通過BCA試劑盒（索萊寶）測定濃度。

1.3 NDM-1酶珠的制備

室溫下將CPG玻璃珠在磷酸鹽緩沖液中用戊二醛減壓下活化30 min，然后在環(huán)境壓力下再活化30 min。將CPG徹底洗滌，收集400 μL活化的CPG，并在室溫下與100 IU NDM-1一起溫育2 h，4℃上下翻轉過夜。洗滌酶結合的CPG，加入1 mL BSA（10 mg/mL）阻斷酶柱剩余活性位點。孵育2 h后，洗滌CPG，完成NDM-1酶固相。

1.4 抗生素濃度的測定

根據每種抗生素的標準曲線，通過UV/Vis分光光度計（安捷倫）測定用可溶性或固定化NDM-1預處理的溶液中抗生素的濃度。將1000 mg/L的抗生素溶液2倍連續(xù)稀釋至1.83 mg/L，然后通過分光光度計在235 nm對頭孢硝噻吩（Nitrocefin）及氨曲南（Aztreonam，ATM）分別在486 nm及292 nm波長下進行掃描，測量每個標準濃度下的吸光度，并根據吸光度值以確定以上抗生素進行定量分析的線性范圍[16]。頭孢硝噻吩及氨曲南的檢測線性范圍分別為 1.25 mg/L～125 mg/L 及 3.2 mg/L～125 mg/L。當對反應產物中的頭孢硝噻吩進行檢測時，氨曲南在254 nm的波長掃描下檢測背景讀數為0。

由于以分光光度計方法分析NDM-1水解氨曲南/美羅培南或氨曲南/青霉素G水解產物中美羅培南或青霉素G濃度時氨曲南會干擾美羅培南或青霉素G的檢測，而氨曲南用中性羥胺法進行定量分析時，氨曲南不顯色，不會對共存的其他抗生素的定量分析產生背景干擾，所以本研究中使用中性羥胺法來測定NDM-1水解氨曲南/美羅培南產物或氨曲南/青霉素G產物中美羅培南或青霉素G的濃度[17]。中性羥胺法檢測β內酰胺類抗生素濃度的方法同前期報道[18]，即取抗生素水解產物1份，先后加入相同體積的中性羥胺及體積比為95%的乙醇，反應3 min，再加入兩份體積的硫酸鐵銨混勻，最后用Nano Drop（Thermo公司）對抗生素/羥胺混合物在515 nm波長下進行掃描，檢測水解產物中的美羅培南或青霉素G濃度。美羅培南或青霉素G濃度根據標準物用羥胺檢測法建立的標準曲線進行計算。

1.5 抗生素水解實驗及水解率的計算

1.5.1 頭孢硝噻吩水解試驗及水解率計算

以0.04、0.2或是1 IU/L的NDM-1處理5 mmol/L頭孢硝噻吩與4.6 mmol/L、2.3 mmol/L、1.15 mmol/L、0.57 mmol/L或0.28 mmol/L氨曲南的混合物1 h或13 h。另外以NDM-1只處理頭孢硝噻吩的樣品為陽性對照。在反應1 h或13 h后取部分上清用Nanodrop檢測頭孢硝噻吩水解產物的濃度（486 nm）。頭孢硝噻吩的水解率公式為（每個樣品中頭孢硝噻吩水解產物的數量/陽性對照樣品中頭孢硝噻吩水解產物的數量）×100。

1.5.2 美羅培南水解實驗及水解率計算

以1 IU/L NDM-1處理4.6 mmol/L美羅培南與4.6 mmol/L、2.3 mmol/L、1.15 mmol/L、0.57 mmol/L或0.28 mmol/L氨曲南的混合物1 h或是13 h。另外，以無NDM-1的4.6 mmol/L美羅培南樣品為陽性對照。反應1 h或13 h后取部分上清進行羥胺染色反應，后用Nanodrop檢測染色液中美羅培南的剩余量（515 nm）。美羅培南的水解率公式為（1-每個反應中美羅培南的剩余量/陽性樣品中美羅培南的量）×100。

1.5.3 青霉素G水解實驗及水解率計算

以15 μL的NDM-1酶珠在存在或不存在4.6 mmol/L氨曲南的條件下處理5.4 mmol/L青霉素G 1 h，收集20μL反應上清作為第1次處理后樣品待測。PBS清洗3次，然后向先前以青霉素G單獨處理和青霉素G/氨曲南混合物處理的兩份酶珠中都加入5.4 mmol/L的青霉素G重新處理1 h，收集20 μL反應上清作為第2次處理后樣品待測。PBS清洗3次，然后再次向兩份酶珠中加入5.4 mmol/L的青霉素G重新處理1 h，收集20 μL反應上清作為第3次處理后樣品待測。以沒有用NDM-1酶珠處理的5.4 mmol/L青霉素液作為反應的陽性對照。把3次收集的樣品用羥胺染色法對其中青霉素G的剩余量進行檢測。青霉素G的水解率公式為（1-每個樣品中青霉素G的量/陽性對照樣品中青霉素G的量）×100。

在以上3種水解實驗中，樣品中抗生素濃度以該抗生素標準品所繪制的標準曲線計算而來。

1.6 NDM-1酶穩(wěn)態(tài)動力學參數測定

利用分光光度計的方法在30℃含有10 μmol/L ZnSO4的PBS緩沖液（pH=7.0）中分析NDM-1對美羅培南水解反應中的酶穩(wěn)態(tài)動力學參數。用294 nm波長對NDM-1水解美羅培南活力進行5 min的持續(xù)檢測，通過美羅培南吸光度的減少來計算美羅培南的濃度。通過測定不同美羅培南濃度下的反應初始速率獲得動力學常數（Km、Kcat及Kcat/Km）。使用Graphpad Prism 5.0軟件擬合和分析初始速率的濃度依賴性以產生米氏方程。

1.7 統計學分析

使用GraphPad Prism作圖軟件，對數據分組進行抗生素水解率差異分析。同時，進行未配對t檢驗以確定兩組之間的差異。P＜0.05被認為兩組間差異顯著。P＜0.05及P＜0.01分別用*及**進行表示。

2 實驗結果

2.1 重組NDM-1的表達和活性驗證

重組NDM-1的預測分子量為27.9 kDa，SDS PAGE凝膠中重組蛋白的位置略高于Marker中25 kDa蛋白帶，從而從分子量大小上初步證實了NDM-1的表達（圖1）。通過SDS PAGE凝膠掃描結果可確定純化的蛋白的純度＞95%。純化的蛋白在30℃及含有10 μmol/L ZnSO4的PBS緩沖液中對美羅培南的單位水解活性為108 IU/mg。在相同的條件下純化的NDM-1對美羅培南水解的酶學常數，Km（μmol/L）、Kcat（s-1）和Kcat/Km（s-1μmol/L-1）平均值分別為47、86和0.55。這些數據表明純化的蛋白與NDM-1在蛋白分子量和酶學活性上有相同的特征，且純度很好，所以NDM-1表達、純化成功。然而，即使以相對高濃度的NDM-1純化酶（10 μmol/L）處理氨曲南（100 μmol/L）長達16 h也未觀察到氨曲南發(fā)生水解（數據未提供）。

圖1 以SDS-PAGE凝膠電泳確定重組NDM-1表達Fig.1 Confirmation of recombinant NDM-1 expression by SDS-PAGE

2.2 氨曲南抑制NDM-1水解頭孢硝噻吩和美羅培南

首先研究氨曲南存在時NDM-1對頭孢硝噻吩水解的影響。在由氨曲南、頭孢硝噻及NDM-1組成的反應體系中，當NDM-1濃度在相對較低（0.04 IU/L）和中等水平（0.2 IU/L）的反應條件下，共處理1 h，頭孢硝噻吩被NDM-1水解的百分率隨著氨曲南濃度的減少而增加。且在氨曲南（4.6 mmol/L）和頭孢硝噻吩濃度（5 mmol/L）相似時，頭孢硝噻吩均未見顯著的水解（圖2A和2B）。當NDM-1濃度在相對高水平（1 IU/L）的反應條件下，只有氨曲南為4.6 mmol/L時，頭孢硝噻吩未發(fā)生明顯的水解。在其他氨曲南濃度條件下，頭孢硝噻吩水解都達到80%以上，且各濃度間沒有顯著性差異（圖2C）。當共處理的時間達到13 h，在所有3種NDM-1濃度條件下，當氨曲南濃度為4.6 mmol/L時，頭孢硝噻吩均未發(fā)生明顯水解。但氨曲南在其他較低濃度條件下，頭孢硝噻吩都能達到75%以上的水解，而且在各濃度氨曲南之間，頭孢硝噻吩水解未見顯著區(qū)別（圖2A，2B和2C）。即使NDM-1濃度高達1 IU/L，在共處理1 h和13 h兩個時間點，濃度為4.6 mmol/L和2.3 mmol/L的氨曲南都能顯著抑制4.6 mmol/L美羅培南的水解。且與頭孢硝噻吩相似，當共處理的氨曲南濃度為4.6 mmol/L時，美羅培南幾乎沒有明顯的水解（圖2D）。綜上所述，在高濃度氨曲南存在的條件下，NDM-1水解頭孢硝噻吩和美羅培南的活性均被顯著抑制。

圖2 評價氨曲南對NDM-1水解頭孢硝噻吩和美羅培南的影響Fig.2 Evaluation of effect ofAztreonam on hydrolysis of Netrocefin and Meropenem by NDM-1

2.3 氨曲南與NDM-1穩(wěn)定地結合抑制NDM-1對青霉素G的水解

為研究氨曲南抑制NDM-1水解頭孢硝噻吩和美羅培南的機制，研究了氨曲南對固相在CPG玻璃珠上的NDM-1（以下簡稱NDM-1酶珠）對青霉素G（PG）水解的影響。發(fā)現以NDM-1酶珠處理5.4 mmol/L青霉素G和4.6 mmol/L氨曲南混合物時青霉素G的水解率只有（4.6±2.3）%，而以NDM-1酶珠處理無氨曲南共存條件下青霉素G的水解時青霉素G水解率高達（86.9±6.3）%（圖3第1次處理數據）。以上數據說明NDM-1酶珠能夠有效水解青霉素G，但在氨曲南與青霉素G以相似濃度共同存在的情況下，氨曲南能有效抑制NDM-1酶珠對青霉素G的水解。為進一步研究氨曲南抑制NDM-1水解頭孢硝噻吩、美羅培南及青霉素G是否通過競爭性結合機制進行，第1次NDM-1酶珠處理的抗生素樣品被充分洗掉，然后各NDM-1酶珠中再次加入5.4 mmol/L青霉素G進行反應。發(fā)現第1次處理時只加有青霉素G的NDM-1酶珠再次水解青霉素G后，青霉素G的水解率與第1次處理時相似高達（92.5±4.4）%。而第1次處理時共同加入青霉素G和氨曲南的NDM-1酶珠再次加入青霉素G進行反應后，雖然青霉素G水解率相對于第1次與氨曲南共處理時顯著增加（54.7±13.3）% 相對于（4.6±2.3）%，但與第1次處理時只加入青霉素G的酶珠在第2次處理時對青霉素G的水解率（92.5±4.4）%相比仍然明顯較低（圖3中標記的第2次處理數據部分）。對第2次處理后的酶珠再次充分清洗后，并以與第2次處理酶珠相同的方式以5.4 mmol/L青霉素G第3次處理各酶珠，發(fā)現與第1次處理時只加入青霉素G處理的酶珠相比第1次處理時加入氨曲南共處理的酶珠對青霉素G的水解率仍然低30%左右（圖3中標記的第3次處理數據部分）。這表明與青霉素G單獨處理NDM-1酶珠不同，以氨曲南與青霉素G共同處理的NDM-1酶珠即使經過2輪的清洗仍然只能對新加入的青霉素G進行部分水解。氨曲南是通過與NDM-1形成穩(wěn)定的復合物占據了頭孢硝噻吩、美羅培南及青霉素G與NDM-1結合的位點從而對NDM-1水解這些抗生素起到了強烈的抑制作用。

圖3 評價氨曲南對NDM-1酶珠水解青霉素G的影響Fig.3 Evaluation of effect ofAztreonam on hydrolysis of Penicillin G by NDM-1 immobilized CPG beads.

3 討論

近年來聯合應用氨曲南、頭孢他啶-阿維巴坦治療MBL表達的強耐藥腸桿菌及假單胞銅綠桿菌在臨床治療和體外敏感性實驗都觀察到了好的結果[12-13]。然而其治療機制仍然不完全清楚。本研究中首先以分光光度計的方法分析NDM-1對氨曲南的水解，但發(fā)現即使在相對高濃度NDM-1處理16 h的條件下氨曲南也沒發(fā)生水解。氨曲南共處理能夠顯著抑制NDM-1對頭孢硝噻吩和美羅培南的水解，且這種抑制呈劑量依賴性和時間依賴性（圖2），這表明氨曲南可以抑制NDM-1對頭孢類和碳青霉烯類β內酰胺類抗生素的水解。抑制活性隨著氨曲南的濃度呈正相關說明氨曲南可能是通過競爭性結合NDM-1的活性位點而抑制NDM-1對兩種抗生素的水解；抑制活性隨著氨曲南處理酶水解反應的時間增加而減少說明這種抑制活性是可逆的。為了檢驗氨曲南抑制NDM-1對頭孢硝噻吩和美羅培南的水解是否為競爭性抑制，研究氨曲南對固相化NDM-1水解青霉素G的影響，發(fā)現氨曲南同樣可以抑制固相化NDM-1對青霉素G的水解，而且即使把固相化NDM-1外的游離氨曲南移除并經過多輪清洗后，固相化的NDM-1對青霉素G的水解活性仍然只有60%左右（圖3）。這說明氨曲南可以通過與NDM-1強烈的結合而抑制NDM-1對青霉素G的水解。至此我們發(fā)現氨曲南不僅對NDM-1穩(wěn)定，而且相對于其他三大類β內酰胺類抗生素有更強的NDM-1結合活性，從而還能作為NDM-1的抑制劑廣譜性抑制NDM-1對β內酰胺類抗生素的水解，這意味著在氨曲南、頭孢他啶及阿維巴坦聯合治療MBL表達的革蘭氏陰性菌感染過程中，氨曲南還可能通過抑制MBL對頭孢他啶的水解而增強該治療方案的殺菌效率。本研究拓展了對聯合應用氨曲南治療廣譜耐藥菌機制的理解。