呂良，蘇瑞軍，晉小婷，張立超，李卓玉*

（1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院，山西 太原 030006）

0 引言

四溴雙酚A（Tetrabromobisphenol A，TBBPA）是目前全球廣泛使用的溴代阻燃劑（BRFs）之一[1]，因其熱穩(wěn)定性高而被添加用于環(huán)氧樹脂、聚酯樹脂等產(chǎn)品中，從而使產(chǎn)品擁有優(yōu)良的阻燃性和自熄性。TBBPA在全球年產(chǎn)量近17萬噸，其中我國是亞洲的生產(chǎn)大國[2]。近些年，TBBPA在各種環(huán)境介質(zhì)中被檢出，如沉積物、水體、土壤、大氣等[3-5]。美國國家毒理學(xué)計(jì)劃（NTP）研究證實(shí)，TBBPA暴露導(dǎo)致大鼠甲狀腺激素水平改變，并發(fā)現(xiàn)TBBPA暴露增加了大腸癌的發(fā)病率[6]。2016年國際癌癥研究中心（IARC）將TBBPA列為2A級(jí)致癌物質(zhì)[7]。但環(huán)境濃度暴露下TBBPA對肝的致癌風(fēng)險(xiǎn)尚需進(jìn)一步評(píng)估。

肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）有較高發(fā)病率和死亡率，是五大常見癌癥之一[8]。我國新診斷肝癌患者占全世界肝癌人數(shù)的60%，其死亡率居惡性腫瘤第二位[9]。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，正常的肝細(xì)胞會(huì)從卵石狀向長梭形轉(zhuǎn)變，同時(shí)許多肝癌標(biāo)志物的表達(dá)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，對肝癌進(jìn)展有重要影響。GPC-3是一種在肝癌組織中高表達(dá)的蛋白，是肝癌早期的敏感標(biāo)記物[10]。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，主要參與破壞細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移[11]。VEGF是血管生成因子，在肝癌組織中高表達(dá)[12]。腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的VEGF分泌到腫瘤微環(huán)境，能夠促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管的生成，從而利于腫瘤細(xì)胞生長、浸潤以及轉(zhuǎn)移[13-15]。因此，通過檢測上述肝癌標(biāo)志物表達(dá)量的變化，能夠有效地評(píng)估環(huán)境濃度TBBPA長期暴露的致肝癌風(fēng)險(xiǎn)。

有研究表明高濃度TBBPA引起人正常肝細(xì)胞L02氧化應(yīng)激ROS升高，降低細(xì)胞線粒體膜電位（MMP）并增加細(xì)胞凋亡水平[16]。TBBPA對肝癌細(xì)胞HepG2的毒性作用及劑量研究表明，TBBPA對HepG2細(xì)胞具有明顯毒性，基準(zhǔn)劑量值為 9.45 μmol/L[17]。并隨TBBPA濃度增加（＞1 μmol/L）HepG2細(xì)胞活力下降，ROS過量生成及細(xì)胞凋亡增加[18]。Chen等研究表明暴露于600 mg/kg的TBBPA會(huì)損害鯛魚肝臟[19]。Arnon等研究表明TBBPA對肝臟毒性主要是對組織損害[20]。Yang等研究表明慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和非酒精性脂肪肝的病因與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[21]。然而，低劑量的環(huán)境濃度TBBPA暴露對肝癌的風(fēng)險(xiǎn)尚未報(bào)道。因此本研究以人正常肝細(xì)胞系HL-7702為材料，用低劑量環(huán)境濃度的TBBPA進(jìn)行長期暴露，檢測細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和分子層面的變化。探討TBBPA與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，可為環(huán)境濃度TBBPA長期暴露的致肝癌風(fēng)險(xiǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HL-7702細(xì)胞（ATCC，USA），胎牛血清（Gibco，USA），RPMI-1640培養(yǎng)基（Minibio，China），TBBPA（St.Louis，Mo，USA），DMSO（Solarbio，China），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen Biotech，China），CO2細(xì)胞培 養(yǎng) 箱（Eppendorf Galaxy170S），倒 置 顯 微 鏡（Zeiss，Germany），實(shí) 時(shí) 定 量 PCR 儀（Bio-Rad，USA）。

1.2 HL-7702細(xì)胞的培養(yǎng)

人源正常肝細(xì)胞HL-7702培養(yǎng)于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2，恒溫恒濕條件下。所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞毒性測定

采用CCK-8對細(xì)胞存活率進(jìn)行測定。將生長狀態(tài)良好的HL-7702細(xì)胞用胰酶消化，1 000 r/min離心并制成細(xì)胞懸液，接種到96孔板中（2×103個(gè)/孔）。人體血液樣本中TBBPA的濃度約為1.3×10-8mol/L～9.5×10-12mol/L[22]，因此在細(xì)胞貼壁后，對照組用空白培養(yǎng)基處理，實(shí)驗(yàn)組用含濃度為1.00×10-12、1.00×10-11、1.00×10-10、1.00×10-9、1.00×10-8、1.00×10-7、1.00×10-6、1.00×10-5、1.00×10-4mol/L的TBBPA培養(yǎng)基處理，24 h更換一次培養(yǎng)基，48 h后更換無血清培養(yǎng)基并加入CCK-8，2 h后450 nm下測定吸光值。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

將2×106個(gè)對數(shù)期HL-7702細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，用倒置顯微鏡拍攝0周時(shí)細(xì)胞形態(tài)圖像。將細(xì)胞計(jì)數(shù)，取2×106個(gè)細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，收集余下的細(xì)胞作為0周時(shí)細(xì)胞樣。待傳代細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)基并用PBS緩慢洗3次，加入10 mL含1.00×10-8mol/L的TBBPA培養(yǎng)基處理1周，并拍攝1周時(shí)細(xì)胞形態(tài)圖像。將細(xì)胞計(jì)數(shù)，取2×106個(gè)細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，收集余下的細(xì)胞作為1周時(shí)細(xì)胞樣。第2、3和4周的處理方法與第一周相同。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集TBBPA暴露處理0、2、4周后的HL-7702細(xì)胞樣品，加入Trizol提取總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，然后于實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析。內(nèi)參GAPDH基因?qū)⒛康幕騧RNA表達(dá)量進(jìn)行均一化處理?；虮磉_(dá)變化的計(jì)算采用倍增變化率表示，倍變化增率=2-△△Ct（△Ct為目的基因和內(nèi)參基因Ct值的差值）。實(shí)驗(yàn)引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.6 集落形成實(shí)驗(yàn)

將TBBPA暴露處理0、2、4周的HL-7702細(xì)胞接種于24孔板中（5×103個(gè)細(xì)胞/孔），用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d。吸棄培養(yǎng)基，PBS緩慢清洗3次，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min。吸棄4%多聚甲醛，PBS緩慢清洗3次，加入700 μL 0.5%結(jié)晶紫染色液，染色15 min。吸棄染色液，PBS緩慢清洗3次，室溫干燥。用顯微鏡對染色后的細(xì)胞進(jìn)行拍照，每組重復(fù)3次。將拍照后的細(xì)胞每孔加入700 μL 1% SDS溶液，室溫孵育20 min后混勻，每孔吸取100 μL加入96孔板中（6組平行），用酶標(biāo)儀在波長570 nm下檢測吸光值。集落形成率=（實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值）×100%。

1.7 錨著獨(dú)立性生長實(shí)驗(yàn)

用RPMI-1640培養(yǎng)基配制1.4%的瓊脂糖溶液高溫高壓滅菌15 min，稍冷后放入39℃恒溫水浴鍋中保溫，然后加入預(yù)溫的含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成0.7%瓊脂糖溶液。取6孔板，每孔加入1.5 mL 0.7%瓊脂糖溶液鋪制底層瓊脂，凝固后備用。分別將TBBPA暴露處理0、2、4周的HL-7702細(xì)胞與等體積的0.7%瓊脂糖溶液與細(xì)胞懸液充分混勻，使上層瓊脂糖終濃度為0.35%，每孔加1 mL，接種細(xì)胞密度為5×103個(gè)細(xì)胞/孔。待頂層瓊脂凝固后每孔加入1 mL空白培養(yǎng)基。在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2，恒溫恒濕條件下進(jìn)行培養(yǎng)（每3天更換一次培養(yǎng)基）。待長出單細(xì)胞克隆團(tuán)時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)每組克隆的單細(xì)胞克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×1000‰，用mean±SD表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0和SPSS軟件進(jìn)行分析，用t檢驗(yàn)對樣本均值進(jìn)行比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，*P＜0.05，**P＜0.01，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境濃度TBBPA短期暴露對人正常肝細(xì)胞存活率沒有影響

首先采用CCK-8檢測不同濃度的TBBPA短期暴露對HL-7702細(xì)胞存活率的影響情況。如圖1所示，TBBPA在環(huán)境濃度（1.00×10-12～1.00×10-8mol/L）下對細(xì)胞存活率影響不大，而濃度大于1.00×10-8mol/L時(shí)，隨著濃度的增加細(xì)胞存活率逐漸降低，數(shù)據(jù)表明環(huán)境濃度下的TBBPA對肝正常細(xì)胞的存活率沒有顯著影響。因此，將采用1.00×10-8mol/L的TBBPA長期暴露，探究TBBPA對HL-7702細(xì)胞的致癌風(fēng)險(xiǎn)。

圖1 環(huán)境濃度TBBPA短期暴露對人正常肝細(xì)胞的存活率沒有影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=6）Fig.1 No effect of liver cells viability rate by short-term TBBPAexposure can be observed（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=6）

2.2 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對人正常肝細(xì)胞形態(tài)變化影響

用1.00×10-8mol/L的TBBPA暴露細(xì)胞1～4周后，細(xì)胞形態(tài)變化見圖2。由圖2可知，對照組細(xì)胞呈正常的鵝卵石形狀。經(jīng)TBBPA暴露后，細(xì)胞數(shù)量變化不明顯，部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長梭形的形態(tài)，細(xì)胞間空隙增大，細(xì)胞出現(xiàn)絲狀偽足，呈現(xiàn)癌細(xì)胞的遷移形態(tài)特征。結(jié)果表明：環(huán)境濃度TBBPA長期暴露引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，表明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對HL-7702細(xì)胞有誘發(fā)細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對人正常肝細(xì)胞形態(tài)變化影響（黑色箭頭指示為細(xì)胞偽足，n=3）Fig.2 Effect of morphological in liver cells by long-term TBBPAexposure（Black arrows showed pseudopod of cells，n=3）

2.3 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌早期標(biāo)志物GPC-3的影響

檢測環(huán)境濃度TBBPA暴露HL-7702細(xì)胞0、2、4周后，肝癌早期標(biāo)志物GPC-3的表達(dá)情況。結(jié)果表明，GPC-3表達(dá)量隨TBBPA暴露時(shí)間增加而顯著升高，表明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對HL-7702細(xì)胞有誘發(fā)癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

圖3 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌早期標(biāo)志物GPC-3的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.3 Effect of long-term TBBPAexposure in early marker of liver cancer GPC-3（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

2.4 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌浸潤、轉(zhuǎn)移主要標(biāo)志物MMPs的影響

檢測環(huán)境濃度TBBPA暴露HL-7702細(xì)胞0、2、4周后，肝癌浸潤、轉(zhuǎn)移標(biāo)志物MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況。如圖4所示，隨TBBPA暴露時(shí)間增加，MMP-2表達(dá)量略有升高，MMP-9的表達(dá)量顯著升高。結(jié)果表明：環(huán)境濃度TBBPA長期暴露能夠引起HL-7702細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移標(biāo)志物表達(dá)升高，有誘發(fā)細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

圖4 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌浸潤、轉(zhuǎn)移主要標(biāo)志物MMPs的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.4 Effect of long-term TBBPAexposure in MMPs，the major marker of liver cancer infiltration and metastasis（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

2.5 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對腫瘤相關(guān)血管生成關(guān)鍵標(biāo)志物VEGF的影響

檢測環(huán)境濃度TBBPA暴露HL-7702細(xì)胞0、2、4周后，細(xì)胞中血管生成標(biāo)志物VEGF的表達(dá)情況。如圖5所示，結(jié)果表明：VEGF表達(dá)量隨TBBPA暴露時(shí)間增加而顯著升高，這說明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露促進(jìn)HL-7702細(xì)胞血管生成關(guān)鍵標(biāo)志物VEGF基因表達(dá)，有誘發(fā)細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌瘤內(nèi)血管生成關(guān)鍵標(biāo)志物VEGF的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.5 Effect of long-term TBBPAexposure on VEGF，the key marker of angiogenesis in liver cancer（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

2.6 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對細(xì)胞集落形成的影響

檢測TBBPA暴露處理0、2、4周的HL-7702細(xì)胞的集落形成情況，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明：與對照組相比，集落形成數(shù)量隨暴露時(shí)間增加而顯著增加（圖6 A），圖6 B為定量統(tǒng)計(jì)圖，這說明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露能促進(jìn)HL-7702細(xì)胞集落的形成，有誘發(fā)細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

圖6 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對細(xì)胞平板克隆形成率的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.6 Effect of long-term TBBPAexposure in colony formation efficienty of cells（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

2.7 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對細(xì)胞軟瓊脂克隆形成的影響

軟瓊脂錨著獨(dú)立生長能力和細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。圖7結(jié)果表明，與對照組相比，軟瓊脂克隆形成率隨暴露時(shí)間增加而增加，對照組克隆形成率為（1.67±0.54）‰，TBBPA暴露2周組克隆形成率為（1.89±0.42）‰，TBBPA暴露4周組克隆形成率為（2.28±0.16）‰。表明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露能增強(qiáng)HL-7702細(xì)胞錨著獨(dú)立生長能力，有誘發(fā)細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

圖7 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對細(xì)胞軟瓊脂克隆形成的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.7 Effect of long-term TBBPAexposure in soft agar colony formation of cells（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

3 討論

肝臟是人體中控制葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝和有害物質(zhì)排出的關(guān)鍵器官[23]，是應(yīng)激反應(yīng)的主要器官，具有多種抗壓的酶[24-27]。環(huán)境污染物暴露能引起肝功能異常[28]，誘發(fā)肝臟病變。TBBPA暴露能引起肝母細(xì)胞瘤、血管瘤和大腸腫瘤的發(fā)病率增加[29]。有研究表明，TBBPA暴露引起子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞形態(tài)明顯改變，由卵圓形變成長梭形，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)絲狀偽足[22]。Voulgari等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，細(xì)胞形態(tài)變細(xì)長并出現(xiàn)偽足[30]。在本研究也得到相似結(jié)果，發(fā)現(xiàn)長期環(huán)境濃度TBBPA暴露能夠誘導(dǎo)肝正常細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)改變，提示有引起肝細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。肝癌標(biāo)志物GPC-3、MMPs和VEGF對原發(fā)性肝癌的檢測診斷非常重要。GPC-3在HCC組織中高度表達(dá)，有文獻(xiàn)表明GPC-3可以作為肝癌的一種新的早期標(biāo)志物[10，31]。本研究中環(huán)境濃度 TBBPA 長期暴露人HL-7702細(xì)胞后，早期肝癌標(biāo)志物GPC-3在第2周就發(fā)生顯著升高，表明GPC-3響應(yīng)敏感，預(yù)示細(xì)胞有早期癌變趨勢。MMPs是腫瘤細(xì)胞惡化時(shí)破壞細(xì)胞外基質(zhì)的主要參與者，其典型代表MMP-2和MMP-9與腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切，且MMP-2和MMP-9的高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的重要因素之一[11]。有研究表明，TBBPA顯著誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)升[32]。McCormick等在TBBPA暴露斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)，MP P-2、MMP-9和MMP-13表達(dá)增加2 ～ 8[33]。在本研究中，TBBPA暴露4周后，HL-7702細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著增加，表明TBBPA暴露可以通過影響MMP-2和MMP-9表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的惡化。

VEGF與血管生成密切相關(guān)，參與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，在肝癌組織中VEGF常常高表達(dá)，并分泌到微環(huán)境中促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管的生長[12-15]。VEGF能特異性結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體，促進(jìn)血管生成，從而維持腫瘤的繼續(xù)生長[34-35]。Zheng等研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5細(xì)顆粒物暴露人肺上皮細(xì)胞和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞引起 VEGF、IL-6、MDM-2、AKT-1、STAT、和P-53表達(dá)失調(diào)，在一定程度上解釋了PM2.5細(xì)顆粒物的致癌分子機(jī)制[36]。本研究中TBBPA長期暴露HL-7702細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中VEGF表達(dá)顯著升高，為TBBPA通過促進(jìn)血管生成增加致癌風(fēng)險(xiǎn)提供一定的依據(jù)。

集落形成和錨著獨(dú)立生長實(shí)驗(yàn)是檢測腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性常用的方法[37]。腫瘤細(xì)胞失去接觸抑制，可在平板中形成集落或在半固體瓊脂培養(yǎng)基中形成克隆，具有錨著獨(dú)立生長能力，是惡性腫瘤細(xì)胞重要標(biāo)志[38]。李世珍等研究表明，鈾礦粉暴露支氣管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞呈錨著不依賴性增長，獲得了惡性細(xì)胞特征[39]。唐瑩等研究表明，高劑量煙塵染毒肺泡II型上皮細(xì)胞，細(xì)胞軟瓊脂克隆能力增強(qiáng)，預(yù)示高劑量煙塵染毒引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[38]。本研究中TBBPA長期暴露HL-7702細(xì)胞后，隨暴露時(shí)間增加，HL-7702細(xì)胞的集落形成率和軟瓊脂克隆率增加，說明TBBPA長期暴露誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞呈現(xiàn)錨著不依賴性生長，獲得了某些惡性細(xì)胞的生物學(xué)特性，為TBBPA長期暴露增加致癌風(fēng)險(xiǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，環(huán)境濃度TBBPA長期暴露人正常肝細(xì)胞HL-7702后，誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，細(xì)胞間隙變大，出現(xiàn)絲狀偽足，呈現(xiàn)癌細(xì)胞特征。此外，細(xì)胞內(nèi)早期肝癌標(biāo)志物GPC-3、MMPs和VEGF的表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞集落形成和錨著獨(dú)立生長能力增強(qiáng)。表明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露有誘發(fā)肝細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)，該結(jié)果為評(píng)價(jià)TBBPA的致癌風(fēng)險(xiǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。