袁婉珺，魏海英，耿紅

（山西大學 環(huán)境與資源學院，山西 太原030006）

0 引言

PM2.5是一種常見的空氣污染物，可通過鼻腔和嘴部吸入并深入肺部，沉積在氣道和肺泡中，之后還可能進入循環(huán)系統(tǒng)以引起肺和外部組織的反應[1-3]，造成呼吸系統(tǒng)（急性支氣管炎，急性上呼吸道和呼吸道感染等）和心血管（心肌梗死，動脈粥樣硬化等）疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)，2016年全球城市和農(nóng)村地區(qū)的空氣污染估計每年導致420萬人死亡。PM2.5的化學成分多達數(shù)千種以上，可分為有機和無機兩大類[4]，有機成分中多環(huán)芳烴（PAHs）作為優(yōu)先控制的有毒有害污染物，具有致癌、致畸、致突變性等毒性，且在環(huán)境中廣泛分布[5]。

芳香烴受體（AhR）是一種配體依賴性胞內(nèi)受體，能夠參與環(huán)境毒素、致癌物和化學物的代謝，感應調(diào)節(jié)生物節(jié)律變化，氧化應激等[6]。AhR因此也成為控制許多生理過程的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括細胞的增殖、凋亡、分化、黏附和遷移，參與調(diào)節(jié)自身免疫、感染和癌癥的免疫應答。AhR為研究遺傳和外界環(huán)境因素對健康和疾病免疫應答等生理過程的影響提供了一個模型信號通路，其可介導有毒的環(huán)境化學物質(zhì)如PAHs、2，3，7，8-四氯二苯并-p二惡英（TCDD）或多氯聯(lián)苯（PCB）產(chǎn)生許多反應，從而使AhR在介導炎性反應和維持機體正常發(fā)育與生理功能中發(fā)揮著重要作用[7]。多項體外實驗表明，PM2.5的有機提取物暴露能夠引起炎性因子如環(huán)氧霉素-2（COX-2）、白介素-8（IL-8）、白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的mRNA表達上調(diào)，從而誘導細胞產(chǎn)生炎癥[8-9]。Vogel等人研究發(fā)現(xiàn)，城市揚塵或柴油尾氣中顆粒物的有機提取物誘導了IL-8、COX-2和CYP1A1的高表達，這些基因被認為參與了PM介導的巨噬細胞炎癥反應[10]。

關于PM2.5對巨噬細胞的研究，我們前期的研究主要集中于動物模型的肺泡巨噬細胞，并且表明苯并[b]熒蒽、菲的暴露對大鼠肺泡巨噬細胞造成顯著的細胞毒性[11-12]，但是PM2.5對人體細胞巨噬細胞的毒性機制，特別是PM2.5吸附的PAHs與細胞毒性反應的相關性尚不清晰，因此在本研究中采集太原市冬季PM2.5，分析其PAHs含量，并使用HepG2細胞模型檢測PM2.5是否可以激活芳香烴受體，之后將巨噬細胞U937暴露于太原市冬季PM2.5有機物提取液，分析了CYP1A1和炎癥細胞因子COX-2，IL-8、IL-1β和TNF-αmRNA的表達情況，以闡明PM2.5對人源巨噬細胞毒性的具體機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人源肝癌HepG2細胞和單核系U937細胞株均購于美國ATCC公司；熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒和PTX.DIR質(zhì)粒購于Promega公司；RNA提取試劑盒來自Zymo research公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green核酸染料來自Applied Biosystems公司；實時熒光定量PCR基因引物來自美國IDT公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、葡萄糖、丙酮酸鈉、佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA）、二甲基亞砜（DMSO）、苯并[a]芘（B[a]P）均購于美國Thermo Fisher Scientific公司.

1.2 PM2.5收集和提取

采樣點位于山西大學環(huán)境與資源學院五層樓頂（N37°47′，E112°34′），距離地面約15 m，采用大流量采樣器（Thermo Anderson），流量為1.13 m3/min，配以3 μm孔徑的石英微孔過濾器（Whatman）來收集PM2.5。在采集前，將過濾器在450°C的條件下加熱24 h以去除內(nèi)毒素，并稱量濾膜在采集前的重量。樣品采集于2015年12月15日到12月21日，每次采樣24 h后取下濾膜并稱重，計算顆粒物重量，收集時間持續(xù)7 d。隨后將濾膜剪成碎片，置于裝有超純水（Milli-Q）的錐形瓶中，超聲1 h，提取液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾（大約100 mL），冷凍干燥得到粉末，置于-80°C備用。在使用之前，將提取的PM2.5溶于二甲基亞砜（DMSO；0.1%）中，以制備最終濃度為 10 μg/μL的 PM2.5懸浮液。

1.3 PM2.5中 PAHs的測定

16種PAHs的測定按照（GB-HJ 646-2013）中規(guī)定的方法使用索氏提取法提取濾膜上的樣品，使用GC-MS對各PAHs進行測定。16種PAHs的GC-MS分析條件如下表1所示。

表1 GC-MS測定16種PAHs的分析條件Table 1 Analysis conditions of measuring 16 kinds of PAHs

1.4 熒光素酶的表達與檢測

前期研究表明，AhR能夠被PM2.5吸附的某些PAHs激活并在細胞中表達[13-14]。為了檢測太原冬季PM2.5是否可以激活AhR。本研究使用了人源肝癌HepG2細胞，因為其具有很高的轉(zhuǎn)染效率，細胞內(nèi)可以檢測到很高的AhR蛋白含量，為檢測各種配體激活AhR提供了有效的載體[15-16]。將HepG2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的12孔細胞板中，細胞密度在 2×105和 2×106細胞 /孔之間。使用PTX.DIR（插入含有單純皰疹病毒胸苷激酶（TK）啟動子和熒光素酶報告基因的載體中，與CYP1A1轉(zhuǎn)錄起始位點相關的XRE序列5’-CTCCGGTCCT TCTCACGCAA CGCCTGGGCA-3’從核苷酸-1026延伸至-999）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。實驗設有對照組（DMSO；0.1%），PM2.5組（10 μg/mL），和陽性對照組（B[a]P；10 μg/mL），對轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞進行染毒，每組設置平行4個，37°C下培養(yǎng)4 h。使用熒光素酶檢測系統(tǒng)及熒光分光光度計進行測定，數(shù)據(jù)以相對光單位（RLU）表示。

1.5 人體巨噬細胞U937培養(yǎng)與染毒處理

為了檢測太原冬季PM2.5暴露不同時間引起的巨噬細胞毒性反應，將人源單核U937細胞置于12孔細胞板，含有10%胎牛血清，100 U青霉素和100 μg/mL鏈霉素補充4.5 g/L葡萄糖，1 mmol/L丙酮酸鈉和10 mmol/L HEPES的RPMI 1640培養(yǎng)基中。細胞密度在2×105和2×106細胞/孔之間。為了誘導其分化為巨噬細胞，將U937細胞用佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA；5 μg/mL）處理，并在37 °C含有5% CO2的組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。實驗設計分組同1.4，在37°C下分別培養(yǎng)：6 h，24 h和48 h。

1.6 RNA提取逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR

U937巨噬細胞暴露于PM2.56 h，24 h和48 h后，使用RNA提取試劑盒提取U937巨噬細胞中RNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化cDNA。PCR的反應體積為20μL，按每管10 μL SYBR，8.2 mL ddH2O、0.4 μL 正向引物、0.4 μL 反向引物、1 μL cDNA模板加樣，采用IQ5實時定量PCR儀擴增。反應條件為94℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，均擴增45個循環(huán)，將cDNA按1倍、3倍、9倍、27倍稀釋作標準曲線，采用IQ5軟件將所測結(jié)果與β-actin基因的結(jié)果作比值來確定目的基因的表達量。實驗中所使用的引物序列見表2。

表2 qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for qPCR analysis

1.7 統(tǒng)計分析

使用Graphpad Prism 8.0軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差（SEM）。使用單因素方差分析（one-wayANOVA）和Tukey檢驗用于確定不同處理組之間的統(tǒng)計學顯著性差異，當P＜0.05時被認定為其具有顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 PM2.5中PAHs的含量分析

表3為太原冬季PM2.5中PAHs濃度，由表可知，PAHs的總濃度為70.38 ng/m3，占到PM2.5總量的0.91%。在16種優(yōu)先控制PAHs的中，茚并[1，2，3-cd]芘、苊烯、萘的含量較低，芘、熒蒽、?、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝7種含量較高，尤其是苯并[b]熒蒽在所測有機物中濃度最高為13.66 ng/m3。由圖1可以看出，芘、熒蒽、?、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝這7種化合物含量約占到了16種PAHs含量的72%。

表3 太原冬季PM2.5中PAHs的濃度Table 3 Concentrations of PAHs of wintertime PM2.5 extract from Taiyuan

圖1 太原市冬季PM2.5中不同多環(huán)芳烴（PAHs）百分比Fig.1 Percentage of different PAHs in wintertime PM2.5 extract from Taiyuan

2.2 太原市冬季PM2.5在HepG2細胞中激活AhR的表達

PAHs能夠結(jié)合AhR并誘導一系列的靶向基因的表達從而產(chǎn)生毒性反應[17]。為了檢測太原PM2.5中的PAHs能否誘導AhR表達，將10 μg/mL的PM2.5和B[a]P暴露于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞，檢測熒光素酶的活性，結(jié)果見圖2。與對照組（DMSO）相比，太原冬季PM2.5和陽性對照（B[a]P）均誘導熒光素酶活性顯著增強，分別為對照組的52和44倍（P＜0.01），表明PM2.5激活了HepG2細胞中的AhR。

圖2 太原冬季PM2.5對HepG2細胞熒光素酶活性的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=4）Fig.2 Effects of Taiyuan wintertime PM2.5extracton luciferase activity in HepG2 cells.（*P＜0.05，**P＜0.01 versus control，n=4）

2.3 太原冬季PM2.5在U937巨噬細胞中對CYP1A1表達的影響

很多研究將CYP1A1的表達量作為確定化合物激活AhR的依據(jù)[18]。為了進一步證實PM2.5激活了AhR，本研究測定了CYP1A1mRNA的表達（圖3），在染毒 6 h，24 h和 48 h后，PM2.5組CYP1A1mRNA的表達與對照組（DMSO）相比，均顯著上調(diào)（P＜0.05）。在染毒24 h，與對照組相比PM2.5誘導CYP1A1的表達增加了36倍（P＜0.01）。

圖3 太原冬季PM2.5在U937巨噬細胞中對CYP1A1mRNA表達的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=4）Fig.3 Effects of wintertime PM2.5extract from Taiyuan on the expression ofCYP1A1mRNAin U937 macrophages（*P＜0.05，**P＜0.01versus control，n=4）

2.4 太原冬季PM2.5在U937巨噬細胞中對COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA表達的影響

為了證明PM2.5激活AhR后能夠進一步引起了細胞炎性反應，本研究測定了炎性細胞因子COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA的表達情況（圖4）。PM2.5在U937巨噬細胞中誘導了各炎性因子mRNA的高表達，與對照組相比，均具有統(tǒng)計學上的顯著差異（P＜0.05）。在不同的染毒時間6 h，24 h和48 h，4種細胞因子mRNA表達水平與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05），在染毒24 h達到峰值（P＜0.01），尤其是COX-2和IL-8，其相比于對照組分別增加了4.8和5倍。

圖4 太原市冬季PM2.5在U937巨噬細胞中對COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA表達的影響Fig.4 Effects of wintertime PM2.5extract from Taiyuan on the expression ofCOX-2，IL-8，IL-1βand TNF-αmRNAin U937 macrophages（*P＜0.05，**P＜0.01versus control，n=4）

3 討論

太原市以煤炭為主要能源，長期以來以冶金、機械、化工、煤炭為支柱產(chǎn)業(yè)，是以輸出能源、原材料、礦山機械產(chǎn)品為主的全國重要能源重化工城市。煤炭燃燒、工業(yè)排放等產(chǎn)生的污染物容易吸附于PM2.5表面，使得PM2.5含有很多包括PAHs在內(nèi)的有機化合物[19]。PAHs種類繁多，其中包括苯并[a]芘、苯并[g，h，i]苝、苯并[b]熒蒽等在內(nèi)的16種PAHs對人體健康影響最大。本研究中太原冬季PM2.5中 PAHs的含量為 70.38 ng/m3，其中苯并[b]熒蒽為16種PAHs中含量最高為13.66 ng/m3，苯并[a]芘的濃度為5.013 ng/m3，這幾種化合物的濃度都遠超于《環(huán)境空氣質(zhì)量標準》（GB 3095-2012）（2.5 ng/m3）[20]。此外芘、熒蒽、?、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝在PM2.5中的濃度也較高，PM2.5的有機組成部分尤其是PAHs通過一系列的細胞毒性反應對人體各組織造成急性和慢性毒性[21]。

已有研究已經(jīng)證實，PAHs是PM2.5誘導激活AhR的主要因素[17，22]。AhR作為一種細胞溶質(zhì)受體蛋白，可以結(jié)合各種配體，依據(jù)結(jié)合時間，暴露途徑和細胞因子環(huán)境的不同會不同程度地影響機體免疫系統(tǒng)[23]。正常情況下，AhR在細胞中處于不活躍的狀態(tài)，但是與PA H s結(jié)合后，使A h R與芳香烴受體蛋白（ARNT）締合組成異源二聚體，AhR-ARNT復合物與特定的脫氧核糖核酸（DNA）識別位點二惡英反應元件（DRE）特異性結(jié)合可誘導一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，細胞色素P450家族基因CYP1轉(zhuǎn)錄活動[24]。本研究的結(jié)果也證實了這一反應機理，在PTX.DIR轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中，太原冬季PM2.5誘導了熒光素酶活性的增強，表明AhR被激活。需要說明的是，本研究在熒光酶素測定中使用的是人體HepG2細胞，這是因為HepG2細胞有更高的轉(zhuǎn)染效率[15]，并且在我們前期進行的預實驗中，使用PTX.DIR轉(zhuǎn)染U937和HepG2細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)U937細胞的轉(zhuǎn)染效率遠低于HepG2，并且在熒光素酶測試中AhR在HepG2細胞中的表達量大約是U937細胞的20倍。使用U937巨噬細胞是因為本研究主要側(cè)重于顆粒物對人體巨噬細胞的毒性反應，有文獻表明人源巨噬細胞U937和THP1在檢測空氣PM2.5所表達的炎性反應比較顯著[8，16]，所以我們選取了二者進行了預實驗，在進行qPCR檢測之后發(fā)現(xiàn)炎性因子在U937細胞中表達的更好。雖然HepG2和U937是兩種不同的人體細胞，但仍可為進一步說明太原市冬季PM2.5中的PAHs激活了AhR提供有力依據(jù)。

CYP1A1是一種主要的肝外細胞CYP酶，其將多種外源性和內(nèi)源性化合物（包括PAHs）催化代謝成致癌衍生物的能力已被廣泛研究[25]。CYP1A1是AhR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因，是參與PAH代謝和清除的關鍵酶。作為體內(nèi)一種重要的代謝酶，CYP1A1除了誘導突變，還在感染及炎癥反應過程中起著重要作用[26]。已有研究證實，在感染或炎癥產(chǎn)生時，機體中不同細胞及器官中的CYP1A1表達存在差異，導致內(nèi)源性和外源性化合物的代謝發(fā)生變化，從而在宿主中發(fā)揮保護或損害等不同作用[27]。已有很多研究證實CYP1A1的芳香烴受體（AhR）依賴性調(diào)控機制，本研究在人體巨噬細胞U937中，染毒24 h后PM2.5誘導AhR介導的基因CYP1A1mRNA表達顯著上調(diào)，進一步證明了太原冬季PM2.5激活了AhR。

AhR也可以協(xié)同性地誘導炎癥信號通路中的COX-2或白介素類細胞因子表達導致炎癥的產(chǎn)生[28]。COX-2是調(diào)節(jié)細胞生長，分化和凋亡的重要酶，它的高表達與細胞惡性轉(zhuǎn)化誘導炎癥密切相關[29-30]，而IL-1β，IL-8和TNF-α都是被認為與 PM2.5介導的炎性反應的重要標志物。本研究中太原冬季PM2.5誘導了炎癥因子COX-2、IL-1β、IL-8和TNF-α在人體U937巨噬細胞中的表達，從而誘導了細胞的炎性反應。

綜上所述，太原市冬季PM2.5中的PAHs激活了AhR并且促進了巨噬細胞炎性反應，說明AhR在PM2.5誘導的炎癥反應中起重要的調(diào)控作用，但具體的機制仍需進一步研究。