周寶春，王軟林，柴寶峰

（山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，山西 太原 030006）

0 引言

無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）途徑是一種mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制，保障細(xì)胞內(nèi)基因的精準(zhǔn)表達(dá)。在真核生物的細(xì)胞中，它的功能是用來(lái)識(shí)別和降解含有提前終止密碼子（premature termination codons，PTCs）的異常轉(zhuǎn)錄本，從而避免存在潛在毒性的蛋白截短體產(chǎn)生[1]。這種監(jiān)控機(jī)制不僅在高等真核生物中普遍存在，而且在原生生物的三大超群——陷攝蟲(chóng)群（Ex-cavata）、多貌生物群（Diaphoretickes）和單鞭毛生物群（Amorphea）中均有發(fā)現(xiàn)[2-4]。

在不同進(jìn)化水平的生物中，NMD途徑具有一定的進(jìn)化特征，從高等真核生物到低等原生生物，NMD途徑相關(guān)蛋白因子的種類(lèi)、數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能均存在一定的差異[3]。例如在識(shí)別含PTC轉(zhuǎn)錄本的方式上，進(jìn)化程度相對(duì)較高的哺乳動(dòng)物是以依賴(lài)于外顯子連接復(fù)合體（exon junction complex，EJC）的方式，在停滯的核糖體上通過(guò)招募SMG1（Suppress with morphogenetic effect on genitalia-1）、UPF1（upframeshift 1）和 eRF（eukaryotic release factor）因子形成SURF復(fù)合體，隨后再招募結(jié)合UPF2和UPF3b因子，通過(guò)這兩個(gè)因子再與外顯子連接復(fù)合體結(jié)合[1]。在低等真核生物釀酒酵母中會(huì)招募形成eRF-UPF1-UPF2-UPF3 復(fù)合體[1，5]。而在進(jìn)化程度相對(duì)較低的原生動(dòng)物中，識(shí)別PTC的分子機(jī)制更為復(fù)雜。嗜熱四膜蟲(chóng)（Tetrahymena thermophila）是以一種不依賴(lài)于外顯子連接復(fù)合體的方式，招募形成UPF1-UPF2-UPF3復(fù)合體[6]。賈第蟲(chóng)（Giardia lamblia）可能是以一種依賴(lài)于不均一核小核糖核蛋白1（HRP1）的方式并招募形成SURF復(fù)合體[7-8]。

八肋游仆蟲(chóng)（Euplotes octocarinatus）是一類(lèi)單細(xì)胞原生生物，細(xì)胞中有一個(gè)“C”形營(yíng)養(yǎng)大核和一個(gè)球形生殖小核。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大核中大約含有三萬(wàn)條高拷貝片段化的基因大小染色體（gene size chromosome）[9]，即一條染色體中含有一個(gè)基因。而且，由于游仆蟲(chóng)大核基因閱讀框中存在無(wú)義密碼子編碼氨基酸現(xiàn)象和翻譯移碼現(xiàn)象[10]，使得該類(lèi)生物的NMD途徑機(jī)制更具特殊性。為此，在前期對(duì)八肋游仆蟲(chóng)NMD途徑初步研究的基礎(chǔ)上[11-12]，利用生物信息學(xué)方法對(duì)八肋游仆蟲(chóng)NMD途徑因子進(jìn)行分析，以期對(duì)原生動(dòng)物NMD途徑的深入研究提供支持，具體包括NMD相關(guān)蛋白因子的同源鑒定和結(jié)構(gòu)功能域注釋、核心蛋白因子eUPF1與eUPF2的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分子對(duì)接和相互作用的關(guān)鍵氨基酸分析。最后利用定點(diǎn)突變和Pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證eUPF2與eUPF1之間相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域與預(yù)測(cè)結(jié)果的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

八肋游仆蟲(chóng)（69號(hào)）為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，菌株E.coliDH5α、E.coliBL21為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pGEX-6P-1、pET-28a分別用于重組載體的構(gòu)建和體外基因原核表達(dá)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

EasyTaq?DNA Polymerase、EasyPure?Quick Gel Extraction Kit試劑盒、TransStart?FastPfu FlyDNA Polymerase、EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、High Pure dNTPs、His抗體及GST單克隆抗體購(gòu)自Transgene公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；Plasmid Mini KitI購(gòu)自O(shè)MEGA公司；寡核苷酸引物合成和重組載體測(cè)序由華大基因有限公司完成；PMSF蛋白酶抑制劑購(gòu)自于BBI Life Sciences公司；Eastep?Super Total RNA Extraction Kit試劑盒購(gòu)自Promega公司；Tris購(gòu)自Solarbio公司；配制LB培養(yǎng)基所用酵母粉、蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid公司；氯化鈉、瓊脂粉購(gòu)自Sangon公司。

1.3 生物信息學(xué)分析

為了鑒定八肋游仆蟲(chóng)中NMD途徑相關(guān)蛋白因子，首先從 UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）中下載人類(lèi)NMD途徑相關(guān)蛋白因子的氨基酸序列，然后在游仆蟲(chóng)大核基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ciliates.ihb.ac.cn/database/home/#eo）[9]中 作 tblastn 搜索。再將得到的序列，在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中作blastx序列比對(duì)，進(jìn)一步對(duì)獲取的基因序列作驗(yàn)證。四膜蟲(chóng)NMD相關(guān)蛋白因子基因序列下載自TGD（http：//ciliate.org/index.php/home/welcome）；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NMD相關(guān)蛋白因子基因序列下載自SGD（https：//www.yeastgenome.org/）；藍(lán)氏賈第蟲(chóng)NMD相關(guān)蛋白因子基因序列 下 載 自 GiardiaDB（https：//giardiadb.org/giardiadb/）；擬南芥（Arabidopsis thaliana）NMD相關(guān)蛋白因子基因序列下載自TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）。

蛋白多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)采用Mega 7.0.14 軟件[13]，采用 Jalview2.10.5 軟件[14]進(jìn)行可視化。其他生物中的同源蛋白序列均下載自Uni-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)。eUPF1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型采用Swiss-model（https：//www.swissmodel.expasy.org/）[15]進(jìn)行在線(xiàn)預(yù)測(cè)，eUPF2 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型通過(guò)Zhang Lab I-TASSER Protein Structure&Function Predictions（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）進(jìn)行在線(xiàn)預(yù)測(cè)[16]。采用 InterPro Protein sequence analysis（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）對(duì)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域注釋?zhuān)焕肸DOCK SERVER（http：//zdock.umassmed.edu/）進(jìn)行蛋白分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果采用PDBePISA（http：//www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver）[17]進(jìn)行 相互作用 關(guān)鍵氨基 酸位點(diǎn)的尋找，采用Discovery Studio 4.5 Visualizer軟件分析相互作用蛋白因子間的疏水作用和氫鍵。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與突變

以八肋游仆蟲(chóng)cDNA為模板，采用PCR法，用引物BF781/BF782和BF783/BF784分別擴(kuò)增獲取eUPF1 CH結(jié)構(gòu)域和eUPF2 U1BD結(jié)構(gòu)域基因，然后用相應(yīng)的限制酶分別對(duì)目的基因片段和載體進(jìn)行雙酶切（Table 1），最后用T4 DNA連接酶，將目的基因分別克隆到pET-28a和pGEX-6P-1質(zhì)粒上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-eUPF1-CH和pGEX-6P-1-eUPF2-U1BD（WT）；利用定點(diǎn)突變技術(shù)，設(shè)計(jì)引物DT901/DT902，利用PCR法將eUPF2的αA-helix結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的DNA片段進(jìn)行缺失突變，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-eUPF2-U1BD（MT）。

1.5 蛋白純化與Pull-down分析

分別將構(gòu)建好的pET-28a-eUPF1-CH、pGEX-6P-1-eUPF2-U1BD（WT）和pGEX-6P-1-eUPF2-U1BD（MT）重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，過(guò)夜培養(yǎng)。第二天，將陽(yáng)性單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中。在37℃，180 r/min的條件下，培養(yǎng)5 h后，加入IPTG誘導(dǎo)劑，16℃低溫誘導(dǎo)過(guò)夜，使融合蛋白大量表達(dá)。離心收菌，加入PMSF蛋白酶抑制劑，冰浴超聲破碎細(xì)胞，4℃離心收集帶標(biāo)簽（GST/His）融合蛋白上清液，將收集的兩種蛋白上清液混合，混合均勻后分成兩等份，一份緩慢注入平衡過(guò)的含Glutathion-Sepharose 4B柱材料的柱子中，另一份緩慢注入平衡過(guò)的含Ni-NAT柱材料的柱子中，冰浴過(guò)夜結(jié)合。用洗滌緩沖液除去雜蛋白，隨后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。洗脫的目的蛋白經(jīng)低溫濃縮后制備樣品。質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% SDS-PAGE電泳后，對(duì)互作蛋白分離，Western blot濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至NC膜上，封閉液中封閉1 h，PBST溶液充分洗膜后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶分別稀釋Anti-GST/Anti-His一抗（1∶1000稀釋?zhuān)┖蜔晒舛梗?∶1000稀釋?zhuān)Ｔ賹⒛ぶ糜诘鞍讟?biāo)簽相對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液中，4℃過(guò)夜孵育。然后用PBST溶液充分洗膜，再將膜置于熒光二抗稀釋液中孵育2 h，最后用PBST溶液清洗膜上殘留二抗，利用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)成像。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 八肋游仆蟲(chóng)NMD途徑相關(guān)蛋白因子的鑒定

陷攝蟲(chóng)超群類(lèi)生物處在真核生物進(jìn)化譜系最早的分支，進(jìn)化程度最低[2，4]，對(duì)于研究 NMD 途徑的起源與進(jìn)化十分重要。而藍(lán)氏賈第蟲(chóng)剛好處于這一分支，所含NMD因子在種類(lèi)上比較少，不存在外顯子連接復(fù)合體組分蛋白因子。在多貌生物超群中，八肋游仆蟲(chóng)和嗜熱四膜蟲(chóng)均屬于囊泡蟲(chóng)超門(mén)（Alveolatas）中的纖毛蟲(chóng)類(lèi)。擬南芥則屬于陸生高等植物，其N(xiāo)MD核心蛋白因子種類(lèi)都在兩種及以上，也含有EJC組分蛋白因子。真菌和動(dòng)物界均劃定在單鞭毛超群中，釀酒酵母的NMD相關(guān)蛋白因子種類(lèi)也比較少，而人類(lèi)的因子種類(lèi)最為豐富。對(duì)于mRNA降解相關(guān)蛋白因子，無(wú)論物種進(jìn)化程度高低，在各種生物細(xì)胞中均存在。從八肋游仆蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)同源比對(duì)鑒定到11種NMD相關(guān)蛋白因子基因（圖1），包括UPF1（GenID：Contig 9114）、UPF2（GenID：Contig 14745）、MAGO（Gen-ID：Contig 11747）、Y14（GenID：Contig 15189）、UAP56（GenID：Contig 12743）、eIF4AIII（GenID：Contig 8403）、POP2（GenID：Contig 5432）、Exosome（GenID：Contig 25198）、XRN1（GenID：Contig 15461）、DCP2（GenID：Contig 21304）和PABP（Gen-ID：Contig 7968）。

圖1 八肋游仆蟲(chóng)與其他生物的NMD途徑相關(guān)同源蛋白因子比較Fig.1 Comparison of NMD pathway-related homologous protein factors betweenE.octocarinatusand other organisms

表1 本研究所用到的寡核苷酸引物Table 1 List of oligonucleotide primers used in this work

用人類(lèi)SMG1蛋白氨基酸序列在Euplotes octocarinatusGenome Database中作tblastn搜索時(shí)，得到一條屬于PIKK（Phosphatidylinositol 3-kinase-reated protein kinase）蛋白激酶家族的序列，PIKK蛋白激酶家族由SMG1、ATM、ATR、PRKDC和mTOR成員組成，它們?cè)诨驕?zhǔn)確表達(dá)的監(jiān)控上起到重要作用[18]，功能結(jié)構(gòu)域注釋和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果（圖2）顯示，其與 mTOR（mammalian target of rapamycin）聚為一支，所以認(rèn)為mTORL蛋白（GenID：Contig 9214）可能是八肋游仆蟲(chóng)的PIKK家族成員。對(duì)mTORL的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在其N(xiāo)端沒(méi)有人類(lèi) mTOR 的 HEAT（huntingtin，elongation factor 3，PP2A and TOR1）重復(fù)結(jié)構(gòu)域，而是未知功能的結(jié)構(gòu)域DUF3385，但擁有FAT、FRB、PIKK和FATC這些PIKK家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

圖2 八肋游仆蟲(chóng)mTORL蛋白功能結(jié)構(gòu)域注釋?zhuān)ˋ）及PIKK家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（B）Fig.2 Schematic representation of mTORL ofE.octocarinatus（A）and phylogenetic tree of PIKK family proteins（B）

對(duì)鑒定到的這些NMD相關(guān)蛋白因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)域注釋?zhuān)▓D3）。八肋游仆蟲(chóng)UPF1與人類(lèi)UPF1的相似度為40%，與嗜熱四膜蟲(chóng)UPF1a的相似度為43%，與嗜熱四膜蟲(chóng)UPF1b的相似度為23%。S/T模體（motifs）是UPF1上蛋白激酶SMG1的磷酸化修飾位點(diǎn)，在八肋游仆蟲(chóng)、嗜熱四膜蟲(chóng)以及酵母UPF1蛋白中均沒(méi)有人類(lèi)UPF1蛋白C末端的S/T模體，并且在這三種生物細(xì)胞中也都沒(méi)有找到SMG1蛋白因子。八肋游仆蟲(chóng)UPF2具有3個(gè)MIF4G結(jié)構(gòu)域，與人類(lèi)UPF2蛋白相似度為18%，與嗜熱四膜蟲(chóng)UPF2蛋白相似度為17%；鑒定到的八肋游仆蟲(chóng)的四種外顯子連接復(fù)合體組分蛋白因子eIF4AIII、MAGO、Y14和UAP56中，前三種是EJC核心蛋白組分，其與人類(lèi)相應(yīng)的因子相比，相似度分別為65%、67%、41%和59%；與嗜熱四膜蟲(chóng)相比，相似度分別為67%、68%、36%和45%。加工體（processing body，P-body）是真核生物細(xì)胞中mRNA降解的場(chǎng)所[19-20]，從八肋游仆蟲(chóng)基因組中分別鑒定到的P-body組分蛋白有XRN1、POP2和DCP2。這三種蛋白與人類(lèi)同源蛋白相似度分別為24%、38%和19%。外切體（exosome）在mRNA去腺苷酸化后會(huì)沿著5′→3′的方向降解mRNA[21]，八肋游仆蟲(chóng)外切體蛋白與人類(lèi)外切體9相似度為22%。PABP（poly A binding protein）蛋白與Poly（A）尾巴的結(jié)合對(duì)于維持mRNA的穩(wěn)定性以及無(wú)義mRNA的識(shí)別至關(guān)重要[22]，八肋游仆蟲(chóng)PABP蛋白與人類(lèi)PABP蛋白的相似度為23%。

圖3 八肋游仆蟲(chóng)NMD相關(guān)蛋白因子功能結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.3 Schematic representation of functional domain of NMD-related protein factors inE.octocarinatus

2.2 eUPF1與eUPF2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與蛋白分子對(duì)接

eUPF1和eUPF2是NMD途徑核心蛋白因子，eUPF1-CH結(jié)構(gòu)域與eUPF2-U1BD結(jié)構(gòu)域之間的相互作用對(duì)于NMD途徑的啟動(dòng)至關(guān)重要。UPF1-CH結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)結(jié)果表明該結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上比較保守（圖4A），CH結(jié)構(gòu)域是一段富含Cys和His殘基的結(jié)構(gòu)域。其中，在eUPF1（71-166 aa），即對(duì)應(yīng)人類(lèi)hUPF1的123-213 aa的這段比對(duì)區(qū)域中，Cys-His占16.67%；對(duì)UPF2-U1BD結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)，及其二級(jí)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)hUPF2-U1BD結(jié)構(gòu)域二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)的結(jié)果（圖4B）表明，eUPF2-U1BD-αA在結(jié)構(gòu)和序列上相對(duì)保守。前期通過(guò)體外Pull-down和酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了eUPF1-CH與eUPF2-U1BD之間的相互作用關(guān)系，并闡明了UPF2對(duì)NMD途徑啟動(dòng)的重要性[11-12]，但這二者之間如何進(jìn)行相互作用仍不清楚。

圖4 八肋游仆蟲(chóng)UPF1-CH和UPF2-U1BD結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)Fig.4 Sequences alignment of UPF1-CH and UPF2-U1BD domains ofE.octocarinatuswith that of other species.（A）Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of UPF1-CH protein.In UPF1（71-166 aa）of E.octocarinatus，using small triangle mark at the conservative sequence of Cys and His residues.（B）Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of UPF2-U1BD protein.The secondary structures of UPF2-U1BD ofE.octocarinatusand human were marked，respectively

蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)決定其功能，采用同源建模預(yù)測(cè)eUPF1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5A）。以人類(lèi)UPF1-UPF2復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID 2wjv.1.A）為模板建模，模型質(zhì)量QMEAN得分為-1.81，可信度GMQE得分為0.66，與模板的相似度為47.91%。對(duì)eUPF2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖5B），模型質(zhì)量評(píng)估系數(shù)C-score得分為-0.48，兩兩結(jié)構(gòu)相似度系數(shù)TM-score得分為（0.65±0.13），兩兩結(jié)構(gòu)間的距離偏差RMSD得分為（8.4±4.5）?。

圖5 八肋游仆蟲(chóng)UPF1與UPF2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其相互作用關(guān)鍵氨基酸分析Fig.5 Prediction of tertiary structure of eUPF1 and eUPF2 proteins and analysis of key amino acids for their interaction

為了進(jìn)一步研究eUPF1-CH與eUPF2-U1BD（αA-helix，767-786 aa）之間相互作用的關(guān)系，將二者進(jìn)行蛋白分子對(duì)接，以hUPF1與hUP2相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和氨基酸為參照，從對(duì)接結(jié)果中挑選合理的對(duì)接模型。對(duì)挑選好的蛋白復(fù)合體模型，采用PDBePISA進(jìn)行在線(xiàn)分析。分析結(jié)果顯示，它們之間的相互作用面積為793.6 ?2，在這種對(duì)接方式下的自由能ΔiG的值為-13.1。

已有研究證實(shí)hUPF1-CH上與hUPF2-U1BD相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基有V157、V161、F192、L193、I233、R236[23]。根據(jù)多序列比對(duì)結(jié)果（圖4A）和PISA結(jié)果，我們推測(cè)eUPF1-CH上與eUPF2-U1BD相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基是V108，V111，F(xiàn)145，L147，I186 和 K189，其中eUPF1-CH 殘基V111、F145和 I186，與hUPF1-CH 殘基 V161、F192和I233在多序列比對(duì)上相一致，eUPF1-CH殘基V108和L147分別對(duì)應(yīng)hUPF1-CH殘基V157的+1位氨基酸和L193的+2位氨基酸，而hUPF1-CH上氨基酸殘基R236對(duì)應(yīng)eUPF1-CH上殘基K189，二者均為帶正電荷的氨基酸，來(lái)維系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。

在hUPF2-U1BD中的αA-helix結(jié)構(gòu)（767-786 aa）中，與hUPF1-CH結(jié)構(gòu)域相互作用的關(guān)鍵氨基酸有 F1113、I1114、L1117、M1120、M1121 和 L1125[23]。而在對(duì)接模型中，eUPF2-U1BD通過(guò)PISA分析、多序列比對(duì)（圖4B）、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖5B），找到兩種因子相互作用的關(guān)鍵的氨基酸是F772、L776、M779、I780、F784 和 K786。其中F772、L776、M779與hUPF2中氨基酸殘基F1113、L1117和M1120在序列比對(duì)上相一致。

對(duì)接模型經(jīng)過(guò)Discovery Studio 4.5 Visualizer軟件進(jìn)行分析（圖5C）后，發(fā)現(xiàn)eUPF2-U1BD中的αA-helix結(jié)構(gòu)與eUPF1-CH相互作用面具有較強(qiáng)的疏水作用（圖5.Ca，Cb）。此外，這兩個(gè)相互作用的結(jié)構(gòu)域還靠氫鍵來(lái)維持（圖5.Cc，Cd），形成氫鍵的氨基酸殘基分別是N116與E768、S101與K786、V111與Q769。

2.3 eUPF2-U1BD空間結(jié)構(gòu)中的αA-helix對(duì)于eUPF1與eUPF2的相互作用起到關(guān)鍵作用

已有研究證實(shí)，在hUPF2-U1BD的N端部分（1108-1128 aa）會(huì)形成一個(gè)長(zhǎng)而微彎的α-螺旋，C末端部分會(huì)折疊形成β發(fā)夾結(jié)構(gòu)（1167-1189 aa）[23]。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)分別獨(dú)立地結(jié)合在hUPF1 CH結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)相對(duì)的面上。在eUPF2蛋白中，通過(guò)多序列比對(duì)以及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，eUPF2-U1BD空間結(jié)構(gòu)存在三個(gè)α-螺旋（圖4B和圖5B），但只有αA與hUPF2-U1BD在結(jié)構(gòu)和序列上與之相對(duì)應(yīng)，即αA-helix結(jié)構(gòu)（767-786 aa）。那么αA-helix是否也是eUPF1與eUPF2之間相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)呢？為了驗(yàn)證這一問(wèn)題，我們利用定點(diǎn)突變技術(shù)，將這段αA-helix對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行缺失突變（圖6A）。然后利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，以野生型為對(duì)照。采用GST Pull down和His Pull down實(shí)驗(yàn)來(lái)分別驗(yàn)證野生型和突變型eUPF2-U1BD與eUPF1-CH之間的相互作用。研究結(jié)果（圖6B）發(fā)現(xiàn)，eUPF2-U1BD突變型喪失了其與eUPF1-CH相互作用的能力，說(shuō)明αA-helix對(duì)于eUPF2-U1BD與eUPF1-CH之間的相互作用至關(guān)重要。

圖6 αA-helix結(jié)構(gòu)在eUPF2-U1BD與eUPF1-CH互作過(guò)程中關(guān)鍵作用Fig.6 Important role of αA-helix for the interaction between eUPF2-U1BD and eUPF1-CH domain

3 討論

縱觀NMD通路的研究歷程，在以人類(lèi)為代表的高等真核生物和以釀酒酵母為代表的低等真核生物上取得了豐碩的研究成果，并提出了多種合理的模型來(lái)解釋含有PTC的轉(zhuǎn)錄本如何被識(shí)別和降解。人類(lèi)NMD途徑（圖7a）監(jiān)控mRNA的質(zhì)量基于首輪的翻譯過(guò)程，當(dāng)核糖體滑動(dòng)停滯到PTC處時(shí)，首先招募形成SURF復(fù)合體，隨后UPF2作為橋梁連接起了與EJC結(jié)合的UPF3b因子，從而提出了依賴(lài)于外顯子連接復(fù)合體的經(jīng)典模型[1]。值得注意的是，PTC需處于最后一個(gè)外顯子連接處上游50-55 nt時(shí)，mRNA才能被NMD識(shí)別和降解，這也被稱(chēng)為“50 nt邊界規(guī)則”[24]。隨著人類(lèi)NMD因子的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)逐漸被解析[23，25-27]，各個(gè)因子間的相互作用又充分得到證實(shí)。而對(duì)于酵母的NMD途徑（圖7b）有學(xué)者提出了“偽3’UTR模型”[5]，認(rèn)為PTC的出現(xiàn)導(dǎo)致了3’UTR的加長(zhǎng)，阻礙eRF3與PABP的正常結(jié)合，觸發(fā)了NMD途徑。

圖7 不同物種識(shí)別含PTC轉(zhuǎn)錄本的機(jī)制比較Fig.7 Schematic diagram showing how different organisms′N(xiāo)MD factors are involved in PTC-containing transcript degradation

原生動(dòng)物在起源與進(jìn)化上處于特殊地位，通過(guò)對(duì)原生動(dòng)物的NMD通路研究，可以更好地了解NMD通路的起源與進(jìn)化，但關(guān)于原生動(dòng)物的NMD通路的研究報(bào)道卻十分稀少。嗜熱四膜蟲(chóng)NMD通路的研究（圖7c）[6]證實(shí)，在敲除了EJC組分核心因子MAGO的基因后，細(xì)胞中含PTC的轉(zhuǎn)錄本不會(huì)因此上調(diào)，且通過(guò)GST-Pull down實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了EJC與UPF3并未有相互作用關(guān)系，進(jìn)而證實(shí)了四膜蟲(chóng)的NMD途徑不依賴(lài)于EJC。通過(guò)基因敲除等技術(shù)手段，證實(shí)了UPF蛋白作為NMD途徑的核心因子，初步推斷了嗜熱四膜蟲(chóng)的NMD模型，但是該模型仍然不系統(tǒng)、不完整。

本課題組之前曾對(duì)藍(lán)氏賈第蟲(chóng)NMD通路（圖7d）進(jìn)行過(guò)研究，基于酵母雙雜交和Pull-down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)停滯在PTC處的核糖體上也會(huì)形成SURF復(fù)合體，隨后UPF1又會(huì)與HRP1相互作用，對(duì)無(wú)義mRNA識(shí)別和錨定，激活了NMD途徑，同時(shí)也證實(shí)了XRN1和Ski7P作為降解含PTC轉(zhuǎn)錄本的下游降解因子[7-8]。此外，課題組前期也對(duì)八肋游仆蟲(chóng)的NMD通路進(jìn)行過(guò)研究[11-12]，發(fā)現(xiàn)八肋游仆蟲(chóng)NMD通路存在UPF1、UPF2、MAGO和Y14因子，基于酵母雙雜交和Pull-down實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了UPF1的CH結(jié)構(gòu)域與UPF2的U1BD結(jié)構(gòu)域之間存在相互作用關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，本研究結(jié)合人類(lèi)同源蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究[23]，即通過(guò)hUPF2 U1BD結(jié)構(gòu)域上保守的α-螺旋和β發(fā)夾結(jié)構(gòu)分別獨(dú)立地與hUPF1 CH結(jié)構(gòu)域中兩個(gè)相對(duì)的面結(jié)合。利用Pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了八肋游仆蟲(chóng)eUPF2可能通過(guò)其保守的αA-helix結(jié)構(gòu)域參與eUPF2與eUPF1之間的相互作用。此外，課題組之前也證實(shí)了Mago與Y14之間的相互作用關(guān)系。本研究在此基礎(chǔ)上又找到一個(gè)EJC核心因子eIF4A3，那么它是否與Mago和Y14存在相互作用關(guān)系仍有待于實(shí)驗(yàn)證明。另外本課題組之前證實(shí)了UPF2的第三個(gè)MIF4G結(jié)構(gòu)域與Y14之間的相互作用關(guān)系，初步提出了eRF1-eRF3-UPF1-UPF2-EJC的模型（圖7e）。然而八肋游仆蟲(chóng)的NMD通路與人類(lèi)相比仍然不完善，不系統(tǒng)。在通路的下游，無(wú)義mRNA又會(huì)被哪些因子降解呢？為此，基于同源序列搜索，從八肋游仆蟲(chóng)大核基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定出11種NMD相關(guān)因子，其中可能直接參與mRNA降解的因子有脫帽酶DCP2、去腺苷酸化酶POP2、外切酶XRN1和外切體exosome，那么這些因子是否也具有類(lèi)似人類(lèi)同源蛋白的功能[1]，仍有待于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在八肋游仆蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中并未找到SMG1，在其他真核生物分類(lèi)譜系中也能找到SMG1缺失的物種（如擬南芥，釀酒酵母）[2]。在人類(lèi)NMD通路中，SMG1可以磷酸化修飾hUPF1的S/TQ模體，改變蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象，調(diào)節(jié)UPF1的解旋酶活性[25]。磷酸化UPF1執(zhí)行完功能后會(huì)被去磷酸化酶PP2A（serine/threonine protein phosphatase 2A）去磷酸化[1]，然而在游仆蟲(chóng)大核基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中也沒(méi)有找到PP2A。那么在SMG1缺失的物種中，UPF1是否需要被磷酸化激活或被其他激酶（如酪氨酸蛋白激酶）激活仍然是NMD機(jī)制懸而未解的重要問(wèn)題。