吳明權(quán)，周 許，彭 偉，朱力陽(yáng)，涂 禾

(四川省骨科醫(yī)院制劑中心，四川 成都 610041)

抑郁癥是一種情感性精神障礙疾病，以情緒低落、思維困難、睡眠障礙、行為異常和意志脆弱等為主要臨床表現(xiàn)[1]。目前，抑郁癥呈現(xiàn)高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率等特點(diǎn)[2]，世界衛(wèi)生組織指出其或?qū)⒊蔀槔^冠心病之后的第二大疾病[3]。需特別注意的是，在臨床上，抑郁亦可多見(jiàn)于強(qiáng)直性脊椎炎、高血壓及腦卒中等疾病的伴隨癥狀，并可以作為獨(dú)立病因加劇疾病的發(fā)展[4-6]。抑郁癥歸屬中醫(yī)“情志病”“郁癥”的范疇，中醫(yī)文獻(xiàn)中多以“癲證”“梅核氣”等疾病描述。中醫(yī)理論認(rèn)為，抑郁癥的病機(jī)與肝氣郁結(jié)，失于疏泄，脾虛致氣血升降出入失常密切相關(guān)，中醫(yī)治療抑郁癥，多以辛開(kāi)苦降治法為基礎(chǔ)，強(qiáng)調(diào)疏肝理氣，最終使肝臟疏泄功能和脾臟升清降濁功能恢復(fù)正常。

黃連味苦，性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。吳茱萸味辛、苦，性熱，歸肝、脾、胃、腎經(jīng)，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉的功效[7]。黃連-吳茱萸是左金丸、反左金丸、變通丸、甘露散和戊己丸等方劑的基礎(chǔ)配伍，是辛開(kāi)苦降治法的經(jīng)典藥對(duì)。黃連與吳茱萸配伍充分體現(xiàn)了辛開(kāi)苦降、寒熱并用、反佐及制性存用等配伍原則，能夠起到調(diào)和脾胃、調(diào)勻寒熱、調(diào)節(jié)升降、調(diào)暢肝脾氣機(jī)和恢復(fù)脾胃運(yùn)化的作用。黃連-吳茱萸配伍常用于干預(yù)肝火上逆、吞酸、瀉痢、痞滿及暑氣等中焦癥狀。早期臨床研究結(jié)果顯示，部分消化性潰瘍患者能夠從抗抑郁藥的聯(lián)合治療中獲益[8]。尤其值得關(guān)注的是，臨床上常用于治療胃腸道潰瘍的黃連-吳茱萸同樣具有干預(yù)抑郁癥的作用。研究結(jié)果表明，吳茱萸堿和小檗堿能夠通過(guò)增加5-羥色胺(5-HT)能神經(jīng)元的受體濃度，對(duì)5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體低表達(dá)的抑郁癥患者具有保護(hù)作用[9]。此外，左金丸乙醇提取物能夠顯著增加由利血平誘導(dǎo)的抑郁癥模型小鼠海馬區(qū)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺與去甲腎上腺素的水平，同時(shí)使紋狀體中去甲腎上腺素、多巴胺及5-HT水平也能顯著增加。在懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和5-羥色氨酸誘導(dǎo)的甩頭試驗(yàn)中，黃連-吳茱萸乙醇提取物也被證實(shí)具有抗抑郁作用[10]。目前，黃連-吳茱萸抗抑郁作用機(jī)制尚不完全清楚，相關(guān)研究多偏重探討一種藥物成分作用于單個(gè)靶標(biāo)，缺乏中藥復(fù)方治療疾病的系統(tǒng)性和整體性證據(jù)。本研究基于中醫(yī)整體觀念，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論和方法，對(duì)黃連-吳茱萸有效成分-靶點(diǎn)和蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行探討，從多成分、多層次、多靶點(diǎn)和多通路作用的角度闡述黃連-吳茱萸治療抑郁癥的作用機(jī)制，以期為黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥的臨床應(yīng)用及開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黃連-吳茱萸化學(xué)成分的收集和活性成分的篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[11](http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取黃連、吳茱萸的化學(xué)成分。輸入關(guān)鍵字“黃連”“吳茱萸”，得到黃連和吳茱萸的化學(xué)成分信息。中藥口服成分(群)需要經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄(absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME)過(guò)程才能發(fā)揮藥效，而口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug likeness，DL)是中藥成分ADME的重要參數(shù)指標(biāo)。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置篩選參數(shù)OB≥30%和DL≥0.18，篩選得到黃連、吳茱萸的有效成分。

1.2 有效成分作用靶點(diǎn)和疾病潛在相關(guān)靶點(diǎn)的收集

通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(swiss institute of bioinformatics)(http://www.swisstargetprediction.ch)預(yù)測(cè)出黃連、吳茱萸有效成分作用靶點(diǎn)，篩選條件為Probability>0.5。在Gene Card數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中以“depression”“depressive disorder”及“depressive”為關(guān)鍵詞，檢索與抑郁癥疾病相關(guān)的靶基因，獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及基因富集分析

采用軟件Cytoscape 3.2.1構(gòu)建黃連、吳茱萸的“成分-靶點(diǎn)”和“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)”交互網(wǎng)絡(luò)，并采用內(nèi)置插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。采用DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)提取多個(gè)基因或者蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息，同時(shí)富集分析得出黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥的基因功能和通路。

2 結(jié)果

2.1 黃連-吳茱萸有效成分篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，篩選出具有良好OB和DL的黃連-吳茱萸潛在有效成分共41個(gè)，其中黃連11個(gè)，具體是berberrubine、epiberberine、(R)-canadine、berlambine、corchoroside A_qt、magnograndiolide、palmidin A、palmatine、coptisine、worenine和moupinamide；吳茱萸27個(gè)，分別是1-methyl-2-undecyl-4-quinolone、1-methyl-2-nonyl-4-quino-lone、evocarpine、icosa-11,14,17-trienoic acid methyl ester、24-methyl-31-norlanost-9(11)-enol、5α-O-(3′-Methylamino-3′-phenylpropionyl) nicotaxine、6-OH-luteolin、evodiamide、fordi-mine、goshuyuamide Ⅰ、goshuyuamide Ⅱ、gossypetin、gravacri-doneshlirine、N-(2-Methylaminobenzoyl) tryptamine、isorha-mnetin、β-sitosterol、sitosterol、rutaecarpine、rutaevine、rutalinidine、1-methyl-2-[(Z)-pentadec-10-enyl]-4-quinolone、1-methyl-2-[(Z)-undec-6-enyl]-4-quinolone、dihydrorutaecarpine、1-methyl-2-pentadecyl-4-quinolone、evodiamine和1-(5,7,8-trimethoxy-2,2-dimethylchromen-6-yl) ethanone；黃連-吳茱萸共有成分3個(gè)，包含obacunone、quercetin和berberine。

2.2 黃連-吳茱萸抗抑郁的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并設(shè)置篩選條件為Probability>0.5，共獲得與藥物成分相關(guān)的靶點(diǎn)51個(gè)。以“depression”“depressive disorder”等作為關(guān)鍵詞，檢索Gene Card數(shù)據(jù)庫(kù)，整合獲得抑郁癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)12 608個(gè)。將黃連-吳茱萸的作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交互篩選，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)46個(gè)。

2.3 成分-疾病-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將黃連和吳茱萸有效成分、作用靶點(diǎn)及疾病相關(guān)靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。在網(wǎng)絡(luò)圖中，六邊形節(jié)點(diǎn)代表疾病抑郁癥；10個(gè)菱形節(jié)點(diǎn)代表黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥的有效成分，分別是小檗堿(berberine)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、吳茱萸次堿(rutaecarpine)、巴馬汀(palmatine)、24-methyl-31-norlanost-9(11)-enol、6-羥基木犀草素(6-OH-luteolin)、棉花素(gossypetin)、谷甾醇(sitosterol)、表小檗堿(epiberberine)和R-四氫小檗堿((R)-canadine)，黃連貢獻(xiàn)5個(gè)成分，吳茱萸貢獻(xiàn)8個(gè)成分，其中小檗堿為共有活性成分；46個(gè)圓形節(jié)點(diǎn)代表疾病和有效成分相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的作用關(guān)系，即203條邊。該結(jié)果表明黃連-吳茱萸中有效成分作用多個(gè)抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)，呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

圖1 黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 “Component-target-disease” network of coptidis rhizoma and euodiae fructus in the intervention of depression

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將46個(gè)黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，得出蛋白質(zhì)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理，網(wǎng)絡(luò)圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示抗抑郁靶點(diǎn)蛋白，邊代表各靶點(diǎn)間的相互關(guān)系，共包含43個(gè)節(jié)點(diǎn)，有3個(gè)靶點(diǎn)未發(fā)生相互作用，101個(gè)邊；圖中圓形節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺代表靶點(diǎn)Degree值，節(jié)點(diǎn)越大，顏色由淺至深，表示抗抑郁靶點(diǎn)貢獻(xiàn)度越大，反之表示越小，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2)、乙酰膽堿酯(acetylcholinesterase，ACHE)、單胺氧化酶A(monoamine oxidaseA，MAOA)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、丁酰膽堿酯酶(butyryleholinesterase，BCHE)和多巴胺受體2(dopamine receptor D2，DRD2)等疾病靶點(diǎn)的Degree值排名靠前，說(shuō)明該類靶點(diǎn)是黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥重要的作用靶點(diǎn)。

圖2 黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Protein interaction network of coptidis rhizoma and euodiae fructus in the intervention of depression-related genes

2.5 基因本體(gene ontology, GO)生物功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

將黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能與通路富集分析，共獲得生物過(guò)程(biological process, BP)101個(gè)，主要涉及多細(xì)胞生物過(guò)程的調(diào)節(jié)(regulation of multicellular organismal process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、代謝過(guò)程(metabolic process)等；細(xì)胞組成(cell composition, CC)23個(gè)，涉及細(xì)胞核(cell nucleus)、內(nèi)膜系統(tǒng)(endomembrane system)和細(xì)胞膜(cell membrane)；分子功能(molecular function, MF)23個(gè)，包括蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)等，見(jiàn)圖3。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中KEGG進(jìn)行通路富集，富集到顯著相關(guān)通路20條。將P值由小到大排列，選取前10位信號(hào)通路，通過(guò)P值和基因數(shù)量來(lái)衡量KEGG富集程度。黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥的前10位信號(hào)通路依次是血清素的神經(jīng)突觸通路(serotonergic synapse)、卵巢類固醇生成通路(ovarian steroidogenesis)、神經(jīng)活性配體-受體互作通路(neuroactive ligand-receptor interaction)、脂肪代謝調(diào)控通路(regulation of lipolysis in adipocytes)、氮代謝通路(nitrogen metabolism)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-cGMP依賴性蛋白激酶通路(cGMP-PKG signaling pathway)、鈣信號(hào)通路(calcium signaling pathway)、胰島素抵抗通路(insulin resistance)、癌癥信號(hào)通路(pathways in cancer)和環(huán)磷酸腺苷通路(cAMP signaling pathway)，見(jiàn)圖4。

圖3 黃連-吳茱萸活性成分干預(yù)抑郁靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過(guò)程富集分析Fig 3 Enrichment analysis of GO biological process of active components of coptidis rhizoma and euodiae fructus in the intervention of depression

圖4 黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥KEGG通路富集分析Fig 4 Enrichment analysis on KEGG pathways of targets from active compounds of coptidis rhizoma and euodiae fructus in the intervention of depression

3 討論

抑郁癥發(fā)病機(jī)制主要涉及到：(1)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT釋放減少，突觸間隙中濃度降低；(2)多巴胺含量或功能異常及其代謝產(chǎn)物異常；(3)去甲腎上腺素功能變化，包括藍(lán)斑核的改變、去甲腎上腺素的利用及突觸前、突觸后的受體異常；(4)5-HT、去甲腎上腺素、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體、受體及相關(guān)酶的改變；(5)炎癥及氧化應(yīng)激水平升高；(6)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平低下。目前臨床上常用的抗抑郁藥主要是通過(guò)選擇性5-HT再攝取抑制、去甲腎上腺素再攝取抑制和調(diào)節(jié)大腦及外周單胺類遞質(zhì)的代謝酶發(fā)揮抗抑郁作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)黃連-吳茱萸藥對(duì)干預(yù)抑郁癥作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，構(gòu)建了黃連-吳茱萸“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，初步明確了黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥的活性成分(群)，主要有小檗堿、β-谷甾醇、吳茱萸次堿、巴馬汀、24-methyl-31-norlanost-9(11)-enol、6-羥基木犀草素、棉花素、谷甾醇、表小檗堿和R-四氫小檗堿，提示黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥成分具有多成分、多層次、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。研究結(jié)果表明，小檗堿作為黃連和吳茱萸的共有成分，可改善由卵巢摘除或者由外周皮質(zhì)酮注射導(dǎo)致的抑郁樣行為[12-13]，對(duì)不同抑郁動(dòng)物模型均表現(xiàn)出良好的抗抑郁作用，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)大腦內(nèi)單胺類成分轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、抗炎、抗氧化作用和提高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平等方面密切有關(guān)[14]。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)中，吳茱萸次堿可以減少小鼠的不動(dòng)時(shí)間，增加小鼠海馬去甲腎上腺素、紋狀體去甲腎上腺素、5-HT和多巴胺的含量，產(chǎn)生抗抑郁作用[10]；β-谷甾醇可能通過(guò)提高5-HT、去甲腎上腺素和多巴胺等中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平來(lái)發(fā)揮抗抑郁的作用[15]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，黃連-吳茱萸能夠通過(guò)調(diào)控PTGS2、ACHE、MAOA、AR、BCHE及DRD2等靶點(diǎn)治療抑郁癥。經(jīng)典的5-HT系統(tǒng)和ACHE異常是抑郁癥發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[16-17]。PTGS2在腦內(nèi)海馬和谷氨酸能神經(jīng)元中表達(dá)，在維持突觸功能、長(zhǎng)期突觸可塑性等方面發(fā)揮作用[18]。MAOA為單胺氧化酶，DRD2和DRD4為多巴胺受體，三者屬于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)范疇。MAOA在單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用，是重要的臨床抗抑郁藥單胺氧化酶抑制劑的藥理學(xué)靶點(diǎn)，亦與抑郁癥密切相關(guān)[19]。以上結(jié)果說(shuō)明黃連、吳茱萸可通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用而充分發(fā)揮抗抑郁的作用，為中藥抗抑郁藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的探究及潛在藥物的研發(fā)提供了新線索。此外，KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要富集在血清素能突觸通路、神經(jīng)活性配體-受體互作通路、鈣信號(hào)通路、CAMP受體通路和cGMP-PKG通路等。抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡與海馬突觸體內(nèi)游離Ca2+濃度顯著升高相關(guān)，提示黃連-吳茱萸藥對(duì)作用的靶點(diǎn)參與了Ca2+信號(hào)通路，從而能夠抑制Ca2+超載引起的能量代謝障礙和神經(jīng)元損傷[20]。cGMP信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)參與神經(jīng)可塑性，主要下游效應(yīng)物是PKG[21]。氟西汀和阿米替林治療8周可增加海馬cGMP含量，進(jìn)而激活下游PKG為主的cGMP信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮抗抑郁作用，提示黃連-吳茱萸藥對(duì)可作用于cGMP-PKG信號(hào)通路，發(fā)揮抗抑郁作用[22-23]。綜合來(lái)看，黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥具有系統(tǒng)性和整體性的優(yōu)勢(shì)。

此外，研究結(jié)果顯示，抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展與微生物-腦-腸軸密切相關(guān)，其機(jī)制涉及神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和菌群代謝產(chǎn)物等多個(gè)方面[24]。通過(guò)調(diào)節(jié)，恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)可以干預(yù)焦慮或抑郁行為[25-27]。另有研究結(jié)果表明，抑郁癥與緊張所致胃潰瘍的癥狀有一些相似之處，胃潰瘍與抑郁癥在神經(jīng)體液系統(tǒng)的病理機(jī)制存在高度相關(guān)，如氟西汀、阿米替林、米氮平及度洛西汀能通過(guò)調(diào)節(jié)去甲腎上腺素和5-HT水平，促進(jìn)胃潰瘍的愈合，減輕胃黏膜出血，該類抗抑郁藥對(duì)胃潰瘍模型都有明顯的抗?jié)冏饔肹28-29]。黃連-吳茱萸乙醇提取物能調(diào)節(jié)應(yīng)激性胃潰瘍大鼠模型腦組織中去甲腎上腺素、5-HT及多巴胺等單胺神經(jīng)遞質(zhì)濃度，通過(guò)神經(jīng)-體液途徑發(fā)揮抗應(yīng)激性胃潰瘍的作用[30]。綜上所述，基于微生物-腦-腸軸角度，深入探究黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥作用機(jī)制是一種新的思路，具有可預(yù)期的研究?jī)r(jià)值，有助于建立黃連-吳茱萸干預(yù)抑郁癥多維證據(jù)鏈。