王淑菁，付瑞，秦驍，劉朝陽，胡雅靈，王增，韓斌，王魁，岳秉飛

1.中國食品藥品檢定研究院，北京100050；2.上海生物制品研究所，上海201403；3.北京科興生物制品有限公司，北京100085；4.華蘭生物疫苗有限公司，河南新鄉(xiāng)453000

疫苗生產(chǎn)過程中，不論是用胰酶進行細胞消化，還是用雞胚傳代培養(yǎng)，均存在外源性病毒污染的風(fēng)險［1-2］。外源性病毒污染不僅影響疫苗的使用效果，且由于部分外源病毒的致病性，可能引起嚴重的生物安全問題［3-4］。降低潛在的外源病毒污染，保證疫苗的安全可靠是生物制品行業(yè)及管理部門的重要職責(zé)?！吨袊幍洹啡浚?015 版）中流感全病毒滅活疫苗及流感病毒裂解疫苗，均屬雞胚培養(yǎng)流感疫苗，規(guī)定這兩種疫苗的種子批毒種需排除3 種外源性禽病毒［禽腺病毒Ⅰ型、Ⅲ型和禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）］污染［5］，禽腺病毒Ⅰ型即雞胚致死孤兒病毒（chicken embryo lethal orphan virus，CELO）、禽腺病毒Ⅲ型即減蛋綜合征病毒（egg drop syndrome virus，EDS）及 ALV 本身引起禽類的傳染病并不嚴重，但往往引起雞群隱性感染，并能垂直感染雞胚，將給生物制品行業(yè)帶來嚴重危害［6］。周斌等［7］使用電鏡觀察及PCR 擴增，發(fā)現(xiàn)鴨肝炎病毒雞胚尿囊液種毒中污染了高濃度的CELO。胡曉苗等［8］調(diào)查活毒疫苗中ALV 的污染情況，隨機抽取國內(nèi)外公司生產(chǎn)的的活毒疫苗，ALV 檢出率為28.57%?！吨袊幍洹啡浚?015 版）規(guī)定的檢測方法是將流感毒種中和后，在雞胚成纖維細胞及雞胚肝細胞上連傳3 代培養(yǎng)，再進行血清學(xué)方法檢測?，F(xiàn)行方法檢測周期長，至少需4 周；檢測步驟繁瑣，需制備原代雞胚肝細胞。因此，急需建立快檢方法，提高檢測效率，縮短檢測時間，以滿足目前季節(jié)性流感疫苗批簽發(fā)和應(yīng)急檢驗的要求。

熒光定量PCR（Q-PCR）具有特異型強、靈敏度高、準確度好、快速等優(yōu)點，是目前病毒檢測的最適方法［9-11］。中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）自開展外源性病毒檢測工作以來，已建立了流感疫苗毒種中3 種外源性禽病毒的Q-PCR 檢測方法。中檢院作為方法建立實驗室，組織3 家流感疫苗企業(yè)（上海生物制品研究所、北京科興生物制品有限公司及華蘭生物疫苗有限公司）為方法驗證實驗室，從方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性、病毒污染模擬試驗及盲樣檢測等方面，進行了實驗室間驗證?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 病毒及載體 CELO、ALV 及小鼠腺病毒（mouse adenovirus，MAdV）均購自 ATCC（編號分別為 VR-432、VR-247 和 VR-550）；EDS 購自獸藥監(jiān)察所（編號：AV114）；小鼠白血病病毒由中檢院實驗動物質(zhì)量檢測室分離保存；H1N1、H3N2 及B 型流感毒種均為北京科興生物制品有限公司送檢留樣樣品，外源性禽病毒檢測均為陰性，于-70 ℃保存；pMD19-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 EASY Dilution（for Real Time PCR）、RNase-free Water、及 DNA ／ RNA 提取試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；Taqman DNA Expression Master Mix 及 ABI 7500 fast 型和 ABI 7500型Q-PCR 儀均購自美國ABI 公司。

1.3 質(zhì)粒標準品的制備 分別以CELO 目的序列（GenBank：U46933.1）29 763 ～ 30 208 bp、EDS 目的序列（GenBank：Y09598.1）17 569 ～ 18 086 bp 及ALV 目的序列（GenBank：DQ365814.1）79 ～ 233 bp為模板，人工合成目的基因序列，克隆至pMD19-T載體中。質(zhì)粒標準品由方法建立實驗室統(tǒng)一制備完成，克隆陽性樣品測序后，序列比對一致率為100%，質(zhì)粒標準品制備成功。

1.4 Q-PCR 擴增 3 種外源性禽病毒的引物、探針均由上海英濰捷基公司合成，序列見表1。PCR 體系每個稀釋度做3 個重復(fù)。反應(yīng)體系為：Master Mix 10 μL，無 RNA 酶水 3.75 μL，引物探針混合液 1.25 μL（引物濃度為 4 μmol ／ L，探針濃度為 2 μmol ／ L），質(zhì)粒DNA 或樣品5 μL，反應(yīng)總體系為20 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)。每個循環(huán)的延伸結(jié)束時檢測熒光信號。

1.5 實驗室間方法的驗證

1.5.1 標準曲線的繪制 質(zhì)粒標準品計算拷貝數(shù)后進行10 倍系列稀釋，以不同稀釋倍數(shù)（1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104及 1 × 103copies ／ μL）的質(zhì)粒為模板進行Q-PCR 擴增。以病毒標準品濃度為橫坐標，循環(huán)閾值（Ct）為縱坐標，繪制標準曲線。曲線參數(shù)合格標準：Slope 在-3 ～ -3.5 之間、R2＞ 0.99、擴增效率（Eff）為90% ～110%。按下式計算質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)。

拷貝數(shù)（copies ／ μL）=（6.02 × 1023）× 10-9（ng ／ μL）／（DNA length × 2 × 320）

1.5.2 靈敏度 將質(zhì)粒標準品稀釋至1 × 108～1 ×100copies ／ μL，每個樣品檢測 3 次。

表1 3 種外源性禽病毒的引物、探針序列Tab.1 Primers and probes of three extraneous avian viruses

1.5.3 特異性 CELO 選擇 EDS、MAdV、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型為特異性驗證對照；EDS 選擇CELO、MAdV、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型為特異性驗證對照；ALV 選擇小鼠白血病病毒、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型為特異性驗證對照。每個樣品3 個重復(fù)。

1.5.4 重復(fù)性 分別對 CELO、EDS 及 ALV 的 1 ×105和 1 × 104copies ／ μL 質(zhì)粒進行試驗內(nèi)及試驗間的檢測，試驗重復(fù)3 次。計算試驗內(nèi)及試驗間拷貝數(shù)和Ct 的CV。

1.5.5 病毒污染模擬試驗 將CELO、EDS 及ALV分別用PBS 從1 × 100開始進行倍比稀釋。取不同濃度梯度的病毒，分別摻入10% H1N1 流感病毒后進行Q-PCR 檢測，模擬外源性禽病毒污染。CELO及EDS 摻入流感病毒的濃度梯度均為1 × 10-1～1 × 10-8；ALV 摻入流感病毒的濃度梯度為 1 × 10-1～1 × 10-6。

1.5.6 盲樣檢測 將CELO、EDS 及ALV 隨機摻入H1N1 流感病毒中，發(fā)給3 家方法驗證實驗室進行外源性禽源病毒檢測，共12 個盲樣。盲樣1 ～4 含CELO；盲樣 5 ～ 8 含 EDS；盲樣 9 ～ 12 含 ALV。

2 結(jié) 果

2.1 CELO 結(jié)果顯示，4 家實驗室的標準曲線參數(shù)、靈敏度、特異性、重復(fù)性、病毒污染模擬試驗及盲樣檢測結(jié)果均一致。標準曲線參數(shù)Slope 在-3.250 ～-3.495 之間，R2值為 0.993 ～ 1，Eff 為 93.263% ～103.105%，均符合定量檢測的要求；靈敏度均達1 ×100copies ／ μL；特異性僅 CELO 檢出，其他病毒均未檢出；試驗內(nèi)及試驗間的CV 為0.02% ～10.66%，均小于15%；檢出CELO 病毒摻入最低檢測限均為1 × 10-7，拷貝數(shù)為 15 ～ 23.16 copies ／ μL；盲樣 4 均為陽性樣品，盲樣1 ～3 均為陰性樣品。見表2。

2.2 EDS 結(jié)果顯示，標準曲線參數(shù)：4 家實驗室Slope 在-3.368 ～ -3.471 之間，R2為 0.997 ～ 1，Eff為94.119% ～98.129%，均符合定量檢測要求；靈敏度：方法建立實驗室靈敏度為 1 × 101copies ／ μL，3 家方法驗證實驗室靈敏度均為 1 × 100copies ／ μL；特異性：4 家實驗室結(jié)果均一致，僅EDS 檢出，其他病毒均未檢出；重復(fù)性：4 家實驗室試驗內(nèi)及試驗間的CV 為0.09% ～9.83%，均小于10%；病毒污染模擬試驗：方法建立實驗室及2 家方法驗證實驗室檢出EDS 病毒摻入最低檢測限均為1 × 10-5，拷貝數(shù)為 12.7 ～ 73.72 copies ／ μL，1 家方法驗證實驗室檢出病毒摻入最低檢測限為1 × 10-4，拷貝數(shù)為47.98 copies ／ μL；盲樣檢測：4 家實驗室結(jié)果均一致，盲樣6 均為陽性樣品，盲樣5、7 及8 均為陰性樣品。見表3。

2.3 ALV 結(jié)果顯示，標準曲線參數(shù)：4 家實驗室Slope在-3.325 ～ -3.449 之間，R2為 0.997 ～ 1，Eff 為94.961%～99.876%，均符合定量檢測要求；靈敏度：方法建立實驗室及2 家方法驗證實驗室靈敏度均為1 × 101copies ／ μL，1 家方法驗證室靈敏度為 1 ×100copies ／ μL；特異性：4 家實驗室結(jié)果均一致，僅ALV 檢出，其他病毒均未檢出；重復(fù)性：4 家實驗室試驗內(nèi)及試驗間的CV 為0.00% ～9.63%，均小于10%；病毒污染模擬試驗，方法建立實驗室及2 家方法驗證實驗室檢出ALV 摻入最低檢測限為1 ×10-4，拷貝數(shù)為 12.24 ～ 34.3 copies ／ μL，1 家方法驗證實驗室檢出病毒摻入最低檢測限為1 × 10-3，拷貝數(shù)為 352 copies ／ μL；盲樣檢測：4 家實驗室結(jié)果均一致，盲樣11 及12 為陽性樣品，盲樣9 及10 均為陰性樣品。見表4。

表2 CELO 實驗室間驗證Tab.2 Interlaboratory verification results of CELO

表3 EDS 實驗室間驗證結(jié)果Tab.3 Interlaboratory verification results of EDS

表4 ALV 實驗室間驗證結(jié)果Tab.4 Interlaboratory verification results of ALV

3 討 論

CELO、EDS 及 ALV 的 Q-PCR 方法驗證中，各實驗室間在標準曲線參數(shù)、特異性、重復(fù)性及盲樣檢測方面均得到一致性結(jié)果。標準曲線參數(shù)均滿足Slope 在-3 ～ -3.5 之間、R2＞ 0.99、Eff 為 90% ～110%的要求；僅特異性病毒出現(xiàn)擴增曲線，其他病毒無擴增曲線出現(xiàn)；試驗內(nèi)及試驗間Ct 和拷貝數(shù)的CV 均 ＜ 15%。

在檢測EDS 及ALV 方法的靈敏度及病毒污染模擬試驗中，實驗室間出現(xiàn)不一致的結(jié)果。方法建立實驗室檢測 EDS 的靈敏度為 1 × 101copies ／ μL，3 家方法驗證實驗室靈敏度均為1×100copies ／μL；在病毒污染模擬試驗中，方法建立實驗室及2 家方法驗證實驗室檢測ALV 最低檢測限為1 × 10-4病毒摻入，1 家方法驗證實驗室為1 × 10-3。不同實驗室間出現(xiàn)1 個數(shù)量級的差異，提示由于人員操作、儀器精密度等原因造成了不同實驗室間方法靈敏度的不同，而實驗室間方法驗證的意義也在于此，盡可能考察方法的各個環(huán)節(jié)，并設(shè)定合理的檢測流程及判定標準。在進行方法的靈敏度限定時，應(yīng)選擇4家實驗室均能檢出的檢測限值作為判定標準。

WHO 及《歐洲藥典》9.8 均規(guī)定雞胚培養(yǎng)流感疫苗生產(chǎn)中應(yīng)進行病毒去除／ 滅活工藝驗證，確保無外源性病毒污染的風(fēng)險。如無法進行病毒去除／ 滅活工藝驗證，則需對流感病毒種子批毒種及單價液均進行外源性禽病毒檢測，并推薦使用快速檢測方法，如PCR 方法，但未列出特異性引物或探針［12-13］。

中檢院實驗動物質(zhì)量檢測室建立了3 種外源性禽病毒Q-PCR 方法，并從標準曲線參數(shù)、靈敏度、特異性、重復(fù)性、病毒污染模擬試驗、盲樣檢測方面開展實驗室間驗證，獲得了一致性結(jié)果，結(jié)果表明，3種外源性禽病毒Q-PCR 檢測方法具有良好的靈敏度、特異性、重復(fù)性，可用于流感疫苗毒種外源性禽病毒的快速檢測，為該快檢方法的進一步推廣應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。