王利彥,周國娜,朱新玉,高寶嘉,*,許會道

1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院, 保定 071000

2 商丘師范學(xué)院 測繪與規(guī)劃學(xué)院,商丘 476000

凋落物是植物生長發(fā)育過程中新陳代謝的產(chǎn)物,有利于促進(jìn)土壤有機碳(soil organic carbon,SOC)的形成和微生物的活性及群落生長繁殖,土壤微生物在凋落物分解、有機質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮著重要作用[1-5]。森林生態(tài)系統(tǒng)中可以通過凋落物添加與去除試驗(detritus input and removal treatments,DIRT)來研究凋落物對土壤微生物群落的影響以及SOC含量的變化規(guī)律[6]。室內(nèi)培養(yǎng)試驗?zāi)軌蚩刂仆寥赖臏囟取⑺趾蚿H狀況,其結(jié)果對今后進(jìn)行野外試驗具有一定的指導(dǎo)和參考價值。

凋落物分解過程中SOC含量與微生物群落的變化特征等內(nèi)容成為當(dāng)前森林生態(tài)學(xué)領(lǐng)域研究的重點內(nèi)容[7]。研究證明,添加凋落物會增加SOC含量和碳氮比[8-9],但也有研究表明添加凋落物與否,SOC含量并無顯著差異[10-11]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受到凋落物數(shù)量和質(zhì)量的影響,進(jìn)而影響土壤碳氮循環(huán)過程[12]。目前通過DIRT試驗研究凋落物數(shù)量變化對土壤微生物的影響研究亦有報道[13-14],研究表明凋落物添加與去除處理使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,且土壤真菌、細(xì)菌、放線菌的PLFA含量具有顯著差異,上述研究未曾針對凋落物的不同添加量與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行深入探討。近年來,室內(nèi)土壤培養(yǎng)實驗結(jié)合Biolog-ECO技術(shù)能夠最大限度地保留微生物群落的原有代謝特征[15],是土壤微生物群落的生理特征和功能多樣性研究的常見方法[16-20]。

目前學(xué)者的研究主要集中在凋落物與土壤養(yǎng)分、土壤微生物的關(guān)系方面,但凋落物對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響以及土壤微生物群落與有機碳的代謝關(guān)系等機制性問題尚不清楚。本研究假設(shè)在凋落物輸入發(fā)生變化時土壤有機碳含量受到土壤微生物群落功能多樣性的影響,以霧靈山核桃楸—蒙古櫟天然混交林的表層土壤為研究對象,通過去除和添加核桃楸與蒙古櫟葉凋落物處理后室內(nèi)恒溫培養(yǎng)并結(jié)合Biolog-ECO方法,分析不同凋落物處理下SOC含量和土壤微生物的碳源利用差異,研究凋落物的去除與添加對SOC含量和土壤微生物群落代謝功能多樣性的影響,探究不同處理下SOC含量變化的土壤微生物群落代謝機理,為核桃楸—蒙古櫟混交林型的可持續(xù)經(jīng)營提供科學(xué)依據(jù)和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本研究的供試土壤為霧靈山國家自然保護(hù)區(qū)1405—1435 m處的核桃楸—蒙古櫟混交林地0—20 cm的表層土壤,土壤類型為粉壤土,土地利用類型為天然混交林,年均溫為7.6℃,年降水量763 mm,田間持水量為21.15%。在該林地內(nèi)設(shè)置面積為20 m×15 m的樣地,去除表層凋落物后按五點采樣法采取0—20 cm的土壤,每個點采集3下,混合成1份,共采集土壤樣品5份,帶回實驗室備用。

1.2 試驗設(shè)計

為保證室內(nèi)培養(yǎng)各個處理土樣的一致性,故將各點采集的土樣混合成一份,去除大型土壤動物、大型植物殘體(殘枝與根系)和凋落物。分別稱取500 g干土的新鮮土壤進(jìn)行挑除根系(CK)、保留根系(No litter,NL)、保留根系并添加單倍凋落物(Haploid litter,HL)、保留根系并添加雙倍凋落物(Double litter,DL)四種處理。將在樣地內(nèi)采集的蒙古櫟、核桃楸以及少部分草本植物的葉凋落物剪碎過2 mm篩后添加并與土壤充分混勻,添加標(biāo)準(zhǔn)為2 g/100 g干土,DL加倍。所添加的凋落物為未分解形態(tài)凋落物,NL、HL和DL的根系保留量為8—10 g。

處理后,裝入1000 mL的培養(yǎng)瓶,各處理重復(fù)3次。調(diào)節(jié)含水量至田間持水量的70%后,置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天采用稱重法補足缺失的水分,在培養(yǎng)至21 d時進(jìn)行破壞性采樣。為對比室內(nèi)培養(yǎng)對SOC含量與土壤微生物代謝活性的影響,測定培養(yǎng)開始前的土壤(before cultivation,BC)和培養(yǎng)第21天時土壤的SOC含量及微生物群落的代謝活性(average well color development,AWCD)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)、McIntosh均勻度指數(shù)、Pielou豐富度指數(shù),測定時均去除土樣中的根系與凋落物。

1.3 研究方法

田間持水量采用環(huán)刀法測定；土壤有機碳采用重鉻酸鉀氧化—高溫外加熱法測定；土壤顆粒組成采用激光粒度分布儀(Bettersize 2000)測定。土壤微生物代謝活性和土壤微生物功能多樣性指數(shù)采用Biolog-ECO方法,根據(jù)溫育96 h時在酶標(biāo)儀所測的吸光度計算求得。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0和Excel 2019 軟件進(jìn)行處理,采用Origin 8.6繪制圖形。采用ANOVA進(jìn)行方差分析,多重比較利用最小顯著差異法(Least-Significant Difference,LSD),文中字母相同代表差異不顯著(P>0.05),字母不同代表差異顯著(P<0.05)。主成分分析(principal component analysis,PAC)采用降維的方法將不同樣本的多元向量變換為互不相關(guān)的主元向量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤有機碳含量的變化特征

從整體上來看,4種不同處理土壤的SOC含量不同：DL的SOC含量最高,CK的SOC含量最低,且隨凋落物添加量的變化,SOC含量呈現(xiàn)上升趨勢(圖1)。

圖1 土壤有機碳含量變化特征

添加凋落物對SOC含量具有顯著的影響。與培養(yǎng)之前(BC)相比,除CK處理的SOC含量減少了4.15%外,NL、HL、DL處理的SOC含量分別增加了1.88%、5.79%和9.29%；去除凋落物與根系處理的SOC含量并無顯著差異(P>0.05),而添加凋落物處理的SOC含量顯著升高(P<0.05)。

凋落物的去除與添加對SOC有不同的影響。去除凋落物處理后,是否含有根系也對SOC含量有顯著差異,NL處理的SOC含量顯著高于CK；而添加凋落物數(shù)量的不同沒有對SOC含量造成明顯影響,HL處理的SOC含量與DL處理無明顯差異(P>0.05)；添加凋落物處理的SOC含量顯著高于去除凋落物處理的土壤(P<0.05)。

2.2 土壤微生物群落代謝活性的變化特征

由圖2可以看出,土壤微生物的代謝活性(AWCD值)總體上呈現(xiàn)S型曲線變化,均隨培養(yǎng)時間的延長而增加,最終趨向于平穩(wěn)；溫育的前24 h內(nèi)變化不明顯,在24 h后進(jìn)入迅速增長階段,且在第48小時時HL和DL對碳源利用的增長速度與利用程度均明顯高于BC、CK和NL并在第168小時時出現(xiàn)“拐點”達(dá)到最大值。

圖2 不同凋落物添加處理土壤微生物平均顏色變化率

與BC相比,CK與NL的平均AWCD值在溫育第144小時后呈現(xiàn)明顯降低,而HL和DL的平均AWCD值則在溫育第48 h時顯著增加(P<0.05)。經(jīng)過21 d的培養(yǎng)后,土壤微生物對碳源的利用程度與培養(yǎng)之前有顯著的差異,而且不同處理間土壤微生物群落代謝活性差異明顯,HL最高,NL最低,表現(xiàn)為HL>DL>CK>NL(表1)；在120 h至168 h之間HL處理的AWCD值明顯大于DL,而且在168 h以后HL和DL兩種凋落物添加處理無明顯差異。

2.3 土壤微生物對不同碳源的利用強度

由圖3可見,脂類是土壤微生物的主要利用碳源,醇類和碳水化合物類利用最少。與培養(yǎng)之前相比,CK和NL處理的土壤微生物除對胺類的利用顯著增加外,對其他碳源的利用均呈現(xiàn)出明顯的下降現(xiàn)象,且對醇類的下降顯著(P<0.05)；而HL和DL處理的土壤微生物對各類碳源的利用均顯著增加(P<0.05)。

圖3 土壤微生物群落對6類碳源的利用程度

室內(nèi)培養(yǎng)21 d后,4種不同的凋落物處理對碳源的利用上呈現(xiàn)出顯著差異。由圖3可以看出,土壤微生物對各類碳源的利用均是DL最高,HL和DL大于CK和NL；CK和NL處理下土壤微生物對醇類的利用上差異顯著,CK>NL；在氨基酸類和酸類的利用上,HL和DL有顯著的差異,DL對氨基酸類的利用顯著高于HL,而HL對酸類的利用明顯高于DL(P>0.05)。

2.4 土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

由表1可以看出,與培養(yǎng)之前相比,在溫育第96小時時各處理間AWCD值及土壤微生物多樣性指數(shù)均出現(xiàn)CK和NL處理降低、HL和DL處理升高的現(xiàn)象,HL處理的AWCD值最高,NL最低。CK和NL處理的土壤微生物群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou豐富度指數(shù)無明顯變化(P>0.05),HL和DL處理則顯著增加；CK和NL處理的各多樣性指數(shù)均較培養(yǎng)之前有所減小,且NL處理的Mcintosh均勻度指數(shù)較BC降低顯著(P<0.05)。室內(nèi)培養(yǎng)21 d后,各處理間的多樣性指數(shù)均有所變化：土壤微生物群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)和Pielou豐富度指數(shù)與凋落物添加量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,表現(xiàn)為DL>HL>NL>CK,且DL和HL、NL和CK差異不顯著(P>0.05)；Mcintosh均勻度指數(shù)則不同,各處理之間有顯著的差異,表現(xiàn)為HL>DL>NL>CK處理(P<0.05)。

表1 土壤微生物群落AWCD值及多樣性指數(shù)

2.5 土壤微生物群落代謝功能主成分分析

通過主成分分析,在31種碳源中提取了4個特征值大于1的主成分分子,累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到99.463%。結(jié)合碎石圖上的斜率變化從中選取貢獻(xiàn)率為74.543%的前兩個主成分因子PC1和PC2(貢獻(xiàn)率分別為46.956%和27.587%)來分析微生物群落功能多樣性(圖4)。如圖4所示,培養(yǎng)前和4種凋落物處理的土壤在PC1和PC2上分布分散。由于PC1和PC2反映的變異較大,計算得到各處理的得分系數(shù)(表2),可以看到培養(yǎng)前后以及不同凋落物處理后綜合得分系數(shù)差異顯著(P<0.05)。

表2 不同凋落物添加處理主成分得分系數(shù)

圖4 土壤微生物群落功能多樣性的主成分分析

將主成分的得分系數(shù)與各單一碳源的AWCD值做相關(guān)性分析(表3),發(fā)現(xiàn)與PC1顯著相關(guān)性的碳源有22種,其中碳水化合物類6種、氨基酸類3種、醇類2種、胺類3種、酸類5種、酯類3種；與PC2顯著相關(guān)性的碳源有10種,其中包括碳水化合物類3種、氨基酸類2種、醇類1種、酸類2種、酯類2種。對PC1和PC2起主要作用的分別是碳水化合物類和氨基酸類,因此碳水化合物類和氨基酸類在主成分分離中發(fā)揮主要貢獻(xiàn)作用。

表3 與主成分1和主成分2的相關(guān)顯著的碳源

2.6 土壤有機碳與土壤微生物多樣性的相關(guān)性分析

對SOC含量與土壤微生物多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析(表4),由表4可以看出土壤微生物多樣性與SOC含量的相關(guān)性在0.4—0.6之間,屬于中等強度水平,Simpson優(yōu)勢度指數(shù)與SOC含量的相關(guān)性最高,為0.637。各個土壤微生物多樣性指數(shù)之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),各多樣性指數(shù)間的相關(guān)性水平都較高,土壤微生物McIntosh均勻度指數(shù)與AWCD值的相關(guān)性最高,其次為Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與Simpson優(yōu)勢度指數(shù),McIntosh均勻度指數(shù)與Pielou豐富度指數(shù)的相關(guān)性最低,為0.902。

表4 多樣性指標(biāo)與SOC含量的相關(guān)性檢驗

3 討論

3.1 凋落物輸入變化對SOC含量的影響

SOC主要來源于凋落物的分解和積累[21],土壤有機碳庫的變化在生態(tài)系統(tǒng)中表現(xiàn)為凈初級生產(chǎn)力與土壤有機質(zhì)分解之間的平衡[22],林地的表層土壤是有機質(zhì)向土壤碳庫轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵場所,能夠表征SOC積累狀況。本研究發(fā)現(xiàn)：凋落物的加倍添加處理使SOC含量顯著增加(圖1),這與前人研究結(jié)果一致[23-24]。因為凋落物在分解過程中向土壤中釋放大量的營養(yǎng)物質(zhì),間接提高了SOC的含量[25]。本研究還發(fā)現(xiàn)HL處理的SOC含量與DL處理并無顯著差異,這與盧勝旭[26]等的研究不一致。說明與添加單倍凋落物相比雙倍凋落物的添加在短期內(nèi)并未對SOC造成更大影響,可能由于凋落物加倍為微生物提供了豐富的底物來源,對土壤有機質(zhì)產(chǎn)生“正激發(fā)效應(yīng)”,從而提高了微生物對土壤SOC的分解使DL處理與HL處理SOC的差異不顯著[27],也有可能是因為一定體積的土壤在短期內(nèi)只能接受有限的有機質(zhì)分解。

在淺層土壤內(nèi)分布著植物細(xì)根[28-29],通過分泌有機物質(zhì)向土壤中輸送有機碳[30],對森林生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)具有重要作用,研究發(fā)現(xiàn)通過根系周轉(zhuǎn)進(jìn)入土壤的有機物質(zhì)是土壤碳庫的重要組成部分,如果忽略根系在SOC積累中的作用,則SOC的研究有失全面[31-33]。本研究也發(fā)現(xiàn)與BC相比,去除凋落物和根系(CK)后SOC含量降低,而去除凋落物保留根系處理(NL)的SOC含量升高,說明根系存在與否對SOC含量有明顯影響,正好印證了這一說法。這是因為不同處理的土壤微生物代謝活性差異明顯(圖2),與BC相比,培養(yǎng)21 d后CK的SOC含量降低可能是由于去除根系與凋落物后,CK土壤中微生物生存環(huán)境發(fā)生改變,微生物數(shù)量減少,以致于儲存在土壤微生物中的SOC含量減少；而NL的SOC含量變化不明顯則有可能是因為NL土壤中所保留的根系為土壤微生物的生存提供了必需的營養(yǎng)源,在短期內(nèi)對土壤微生物數(shù)量沒有造成明顯影響。

3.2 土壤微生物代謝功能對凋落物輸入變化的響應(yīng)

3.2.1對土壤微生物代謝活性的影響

Biolog-ECO方法在土壤微生物功能特征的研究中得到廣泛應(yīng)用,Biolog-ECO板含6大類有31種碳源：碳水化合物類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類、酸類。根據(jù)Biolog數(shù)據(jù)計算得出的AWCD值是表征土壤微生物單一碳源利用能力的重要指標(biāo),能夠反映土壤微生物對碳源的利用程度[34],是表征土壤微生物代謝活性的重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物的生長存在適應(yīng)期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期3個階段[35],本研究中AWCD值呈現(xiàn)S型曲線變化(圖2),正好符合該生長規(guī)律。如圖2所示,土壤微生物在前24 h處于適應(yīng)期對ECO板的碳源利用很少,而經(jīng)歷了24 h后微生物逐漸適應(yīng)了ECO板的生存環(huán)境,進(jìn)入快速生長的對數(shù)增長期,微生物的代謝活性較為旺盛。AWCD值在48 h后開始出現(xiàn)明顯的分化現(xiàn)象,HL和DL的增長速度明顯快于CK和NL,微生物進(jìn)入對數(shù)生長期,說明碳源被大量利用,凋落物的添加刺激了土壤微生物的代謝活性。在120 h至168 h之間HL處理的AWCD值明顯大于DL這一現(xiàn)象可能是由于過多的添加凋落物在一定程度上對土壤微生物代謝活性具有抑制作用,而且在溫育第168 h以后HL和DL的AWCD值無明顯差異則體現(xiàn)出雙倍凋落物的添加與單倍凋落物添加對土壤微生物代謝活性無顯著的影響。

3.2.2對土壤微生物碳源利用的影響

群落代謝功能多樣性指數(shù)可以反映土壤微生物群落利用碳源類型的差異,即土壤微生物的生態(tài)特征。土壤微生物群落功能多樣性是評價土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要生物學(xué)指標(biāo),土壤微生物群落物種組成和個體數(shù)量分布情況能夠通過土壤微生物多樣性指數(shù)反映出來[36-38]。本研究中不同凋落物添加處理培養(yǎng)后與培養(yǎng)前的土壤微生物相比對單一碳源的利用(圖3)以及各多樣性指數(shù)間(表2)均有較大的差異,四種處理的土壤微生物對碳源種類的利用各有側(cè)重,但DL處理的土壤微生物對各種碳源的利用程度最高,其原因在于凋落物可以為微生物生長提供大量碳源與營養(yǎng)元素,添加量越高,越有利于微生物繁殖[39],說明對土壤進(jìn)行凋落物的去除與添加處理后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了顯著地變化。由表2可以凋落物的去除與添加處理對土壤微生物群落的均勻度具有顯著影響,而凋落物去除處理中,是否存在根系對土壤微生物群落的多樣性、豐富度沒有顯著影響,這與胡凱等[40]的研究不一致,但DL和HL兩處理間無顯著差異(P>0.05),說明凋落物的含量與土壤微生物多樣性呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,但是雙倍凋落物的添加在短期內(nèi)無法達(dá)到更為顯著的水平,這一現(xiàn)象是否是由于雙倍凋落物添加會抑制土壤微生物代謝活性還需做進(jìn)一步的研究。

3.2.3對土壤微生物群落代謝功能的影響

凋落物作為土壤有機質(zhì)的重要來源,凋落物輸入量變化可通過改變土壤有機碳和養(yǎng)分含量等, 從而影響土壤微生物群落組成[10]。

在主成分分析中,樣本之間距離的大小代表樣本間相似程度,進(jìn)而反映樣本間微生物群落代謝功能差異的大小,距離越近,對碳源的利用能力越近,代謝功能差異程度越小[41]。采用PCA主成分分析法(PCA)將溫育96 h后Biolog-ECO板每個孔的AWCD值轉(zhuǎn)化為幾個主成分,可以更好地反映微生物代謝功能特征的變化,用于解釋微生物對碳源利用的多樣性。通過PCA分析和不同類型碳源利用強度發(fā)現(xiàn),在對土壤進(jìn)行凋落物去除與添加處理后,土壤微生物對碳源的利用模式具有明顯的差異(圖4),說明PC1和PC2基本上能夠區(qū)分培養(yǎng)前后和不同凋落物處理的土壤微生物群落代謝功能的差異,凋落物進(jìn)入土壤后對土壤微生物的生存環(huán)境產(chǎn)生了重要影響,最終導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性的變化,這與Swift等[42]的研究結(jié)果一致。

土壤微生物多樣性指數(shù)與AWCD值在總體上反映了土壤中微生物群落的變化情況,但不能反映土壤中微生物群落代謝的具體信息[37],還應(yīng)進(jìn)一步分析。

3.3 不同處理下SOC含量變化的土壤微生物群落代謝機理

SOC是土壤微生物生命活動的能量來源,對保持土壤的肥力具有重要作用[43]。碳水化合物和氨基酸是土壤中最活躍的有機碳庫,是微生物生存的主要碳源[44-45],與微生物活性顯著相關(guān)[46-47],同時也是微生物細(xì)胞的組分或代謝產(chǎn)物[44],約占土壤有機質(zhì)總量的10%—20%[48],是土壤活性有機碳庫的重要組成部分[49],可以指示SOC含量的變化[50]。微生物通過分解SOC獲取碳源,以滿足微生物自身生長需求[51]。本研究發(fā)現(xiàn),31種碳源中起主要貢獻(xiàn)作用的是碳水化合物類和氨基酸類,且通過對SOC含量與土壤微生物多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析(表4)發(fā)現(xiàn),土壤微生物多樣性與SOC含量的具有正相關(guān)關(guān)系,說明凋落物去除與添加處理下土壤微生物群落功能多樣性對SOC含量變化具有重要影響。但是本研究的相關(guān)性屬于中等強度水平,說明凋落物去除與添加處理在短期內(nèi)并未對SOC含量造成顯著的差異。而且室內(nèi)試驗還有一定的局限性,不能完全反映野外的自然狀態(tài),將采回的土樣過篩破壞了土壤的物理結(jié)構(gòu),可能引起底物可利用性的增加,造成外源碳的輸入對深層土壤SOC含量的影響被低估,未來需進(jìn)一步研究原位土壤對外源碳輸入的響應(yīng)[52]。

4 結(jié)論

凋落物去除與添加對SOC含量和土壤微生物群落功能多樣性具有顯著影響,但雙倍凋落物處理在短期內(nèi)難以產(chǎn)生顯著作用且在一定程度上對土壤微生物的代謝活性具有抑制作用；不同處理的SOC含量與土壤微生物多樣性具有正相關(guān)關(guān)系,且土壤微生物群落功能多樣性對SOC含量具有重要影響。因此,未來對核桃楸—蒙古櫟天然混交林的管理中應(yīng)注重對凋落物的利用。