嚴(yán)清青 賈林 何梓健 黃耀星 李偉冬

1廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院)消化內(nèi)科，廣州 510180；2廣州市番禺中心醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州 511400

AP是臨床上常見的急腹癥之一，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病情進(jìn)展迅速[1]，特別是進(jìn)展到SAP階段，體內(nèi)大量炎癥遞質(zhì)釋放，可誘發(fā)多個(gè)胰外器官的損傷[2]。肝臟是SAP患者較早發(fā)生損傷的胰外器官[3]。SAP發(fā)生后機(jī)體迅速出現(xiàn)超高代謝、內(nèi)環(huán)境紊亂、免疫功能降低、營養(yǎng)不良及繼發(fā)感染，同時(shí)合并菌血癥、感染性壞死、器官功能衰竭等，這些均與腸屏障功能障礙息息相關(guān)。研究已證實(shí)，腸道菌群紊亂與SAP患者的腸屏障功能障礙和高死亡率有關(guān)，同時(shí)與多種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[4]。因此，維護(hù)腸功能和調(diào)節(jié)腸道菌群對(duì)改善SAP患者的預(yù)后極為重要，早期腸內(nèi)營養(yǎng)支持和給予益生菌治療為常用手段。研究指出，酪酸梭菌(C.butyricum，CB)及其代謝產(chǎn)物丁酸鹽(sodium butyrate，SB)通過減少炎癥因子的釋放調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)并維持腸屏障功能的穩(wěn)定[5]。本研究構(gòu)建ANP大鼠模型，觀察酪酸梭菌或丁酸鹽干預(yù)對(duì)ANP大鼠胰腺、肝臟及腸黏膜變化的影響，探討其發(fā)生機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

40只SPF級(jí)Sprague-Dawley雌性大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041。使用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成正常對(duì)照組、ANP組、酪酸梭菌干預(yù)組(CB組)、丁酸鈉干預(yù)組(SB組)，每組10只。采用經(jīng)胰膽管注射4.5%牛黃膽酸鈉溶液1 mg/kg的方法構(gòu)建ANP模型。CB組大鼠于造模前10 d給予酪酸梭菌1×109CFU/ml灌胃，每天1次；SD組大鼠于造模前10 d給予丁酸鈉100 mg·kg-1·d-1灌胃；對(duì)照組、ANP組灌入等容積生理鹽水。制模后24 h采用左下腹直接穿刺并連接壓力換能器測定大鼠腹腔內(nèi)壓[6]。然后對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉、剖腹，觀察腹腔內(nèi)各臟器大體情況，吸取腹水并計(jì)量。于腹主動(dòng)脈取血，取末端回腸組織10 cm，取出肝臟及胰腺組織。各組織部分即置凍存液氮罐冷凍，部分置10%甲醛中固定。

二、方法

1．血清生物化學(xué)指標(biāo)檢測：取各組血標(biāo)本，以3 000 r/min離心10 min，收集血清，應(yīng)用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀(奧林巴斯AU5400，日本)檢測血淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT、TBil水平。采用ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box1 protein, HMGB1)水平，試劑盒購自英國abcam公司，嚴(yán)格按說明書操作。

2．腸屏障緊密連接蛋白表達(dá)檢測：取凍存的各組大鼠回腸組織，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，12 000 g離心15 min，吸取蛋白上清液，用BCA定量試劑盒確定上樣濃度。采用常規(guī)蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測緊密連接蛋白ZO-1、claudin-1、occludin表達(dá)?？雇肸O-1、claudin-1、occludin一抗購自英國abcam公司，工作濃度分別為1∶1 000、1∶800、1∶1 000；抗兔二抗購自碧云天公司，工作濃度為1∶2 000，轉(zhuǎn)移至暗室顯影，根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書混合發(fā)光液，并按步驟進(jìn)行顯影，反應(yīng)底物濃度，隨后采用Image J分析各蛋白表達(dá)量。

3．胰腺、肝臟組織病理學(xué)檢查：取甲醛固定的各組大鼠胰腺和肝臟組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。由兩位病理科醫(yī)師盲法在光鏡下觀察組織的病理學(xué)改變，并參照改良Schmidt評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7-8]進(jìn)行胰腺組織病理評(píng)分，肝臟病理評(píng)估指標(biāo)按照Camago等[9]提出的肝臟病理分級(jí)內(nèi)容進(jìn)行評(píng)分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組大鼠腹腔內(nèi)壓力變化及腹水量比較

ANP組大鼠腹腔內(nèi)壓力和腹水量均較對(duì)照組明顯增加。CB組、SB組大鼠腹腔內(nèi)壓力和腹水量均較ANP組明顯減少，但仍高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CB組和SB組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 各組大鼠腹腔內(nèi)壓力和腹水量變化

二、各組大鼠血生物化學(xué)指標(biāo)的變化

ANP組大鼠的血淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT、TBil水平均較對(duì)照組明顯增高，提示胰腺及肝臟損傷明顯；ANP組血TNF-α、IL-6、HMGB1含量也明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CB組和SB組大鼠各項(xiàng)生物化學(xué)指標(biāo)均較ANP組明顯下降，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CB組和SB組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

三、各組大鼠胰腺、肝臟組織病理學(xué)改變

對(duì)照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，未見組織水腫、腺泡壞死、白細(xì)胞浸潤；ANP組大鼠胰腺組織水腫、腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂，有大片出血壞死和脂肪壞死，大量白細(xì)胞浸潤；CB組和SB組大鼠胰腺組織水腫程度減輕，出血壞死范圍較ANP組縮小，少量白細(xì)胞浸潤(圖1)。對(duì)照組、ANP組、CB組、SB組大鼠胰腺組織病理評(píng)分分別為1.18±0.05、11.20±1.08、9.45±1.06、9.04±0.89，ANP組顯著高于其他3組，CB組和SB組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而CB組與SB組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

對(duì)照組大鼠肝臟組織未見肝血竇充血和水腫，未見炎性細(xì)胞和肝細(xì)胞氣球樣變，無出血和點(diǎn)狀壞死或片狀壞死；ANP組大鼠肝臟組織可見肝血竇充血水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞氣球樣變化，偶可見點(diǎn)狀壞死；CB組和SB組大鼠肝臟組織肝血竇充血水腫程度較ANP組明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，偶可見肝細(xì)胞氣球樣變，未發(fā)現(xiàn)出血和點(diǎn)狀壞死(圖2)。對(duì)照組、ANP組、CB組、SB組大鼠肝臟組織病理評(píng)分分別為0.56±0.09、2.89±0.73、2.09±0.49、2.12±0.52，ANP組高于其他3組，CB組和SB組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而CB組與SB組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠血生物化學(xué)指標(biāo)的變化

四、各組大鼠腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)水平比較

對(duì)照組、ANP組、CB組、SB組大鼠腸黏膜組織內(nèi)ZO-1蛋白表達(dá)量分別為1.825、0.79、1.25、1.16；claudin-1蛋白表達(dá)量分別為0.58、0.13、0.43、0.37；occludin蛋白表達(dá)量分別為1.06、0.38、0.82、0.79。ANP組均顯著低于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖3)，而CB組與SB組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；CB為酪酸梭菌；SB為丁酸鹽圖1 對(duì)照組(1A)、ANP組(1B)、CB組(1C)和SB組(1D)胰腺組織病理改變(HE染色 ×100)

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；CB為酪酸梭菌；SB為丁酸鹽圖2 對(duì)照組(2A)、ANP組(2B)、CB組(2C)和SB組(2D)肝臟組織病理改變(HE染色 ×100)

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；CB為酪酸梭菌；SB為丁酸鹽圖3 對(duì)照組(1)、ANP組(2)、CB組(3)、SB組(4)大鼠回腸組織緊密連接蛋白表達(dá)

據(jù)報(bào)道，超過80%的SAP患者可出現(xiàn)短時(shí)間或持續(xù)的肝功能異常，而胰腺炎相關(guān)肝損傷的發(fā)生與SAP早期炎性反應(yīng)失控密切相關(guān)[10]。肝損傷后肝臟清除率及解毒功能下降，各種致病物質(zhì)更易進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，為全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生提供了基礎(chǔ)，促進(jìn)多器官功能障礙形成，可見保護(hù)肝臟可延緩多器官功能障礙的發(fā)生，提高臨床治愈率[11]。

腸道菌群是宿主共生微生物的大蓄水池，與宿主協(xié)同共存，保持著動(dòng)態(tài)平衡，提供有益于宿主的生物和代謝功能，參與保護(hù)腸道屏障、營養(yǎng)代謝、調(diào)節(jié)免疫等過程[12-13]。腸功能障礙是SAP常見并發(fā)癥，也是促進(jìn)病情發(fā)展甚至誘發(fā)多器官功能障礙的重要原因。腸道功能障礙包括腸黏膜屏障損傷和腸道動(dòng)力障礙，研究表明腸道菌群可通過影響腸黏膜上皮細(xì)胞更新、腸道通透性、腸道抗菌肽的釋放及腸道黏液層等調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能[14]。近年來，益生菌對(duì)各種腸道疾病的治療作用受到極大關(guān)注，Bongaerts和Severijnen[12]提出應(yīng)該在胰腺炎初期應(yīng)用大量有代謝活性的益生菌，才能起到調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，減少后期繼發(fā)感染，從而改善AP疾病病程。酪酸梭菌是一種常見的腸道共生菌，該菌及其代謝產(chǎn)物丁酸可抑制各種腸道有害細(xì)菌發(fā)育，減少其增殖及產(chǎn)生毒素，減少炎癥因子釋放，修復(fù)腸道屏障并維持其穩(wěn)定。本研究結(jié)果顯示，酪酸梭菌或丁酸鹽干預(yù)后大鼠腹腔內(nèi)壓力、腹水量較未干預(yù)組明顯降低，且TNF-α、IL-6水平顯降低，說明酪酸梭菌能有效降低ANP大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，減輕AP疾病嚴(yán)重程度。

目前已有研究報(bào)道梭菌族Ⅳ和硬壁菌ⅪVa是腸道中產(chǎn)生短鏈脂肪酸的主要菌，且有證據(jù)表面短鏈脂肪酸在減少肝臟炎癥中有一定作用[15]。短鏈脂肪酸不僅可以為機(jī)體腸黏膜細(xì)胞提供能量，調(diào)節(jié)腸道PH，還可以維持腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的完整性，改善腸黏膜屏障功能[16]。本研究結(jié)果表明，酪酸梭菌、丁酸鹽干預(yù)組大鼠AST、ALT、TBil水平明顯下降，且ANP組大鼠緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，經(jīng)酪酸梭菌或丁酸鹽干預(yù)后ZO-1、occludin、claudin1的表達(dá)明顯升高，說明在ANP大鼠模型中酪酸梭菌或丁酸鹽可起到保護(hù)肝損傷的作用，補(bǔ)充酪酸梭菌或丁酸鹽可明顯增強(qiáng)腸黏膜屏障功能，改善ANP并發(fā)肝損傷的嚴(yán)重程度。

總之，酪酸梭菌及其代謝產(chǎn)物丁酸鹽既能減輕ANP合并肝損傷大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)、維護(hù)其腸屏障功能，又能明顯緩解ANP大鼠體內(nèi)肝臟損傷，這一結(jié)果為酪酸梭菌治療SAP合并肝損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突