歐陽(yáng)柳 鄭浩 程文英 陶元平 李慧芬 李小玲 張雷 李勃 郭世偉 胡先貴 金鋼

1海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外三科，上海 200433；2海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝外三科，上海 200433；392493部隊(duì)醫(yī)院內(nèi)三科，葫蘆島 125003；4海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院介入科，上海 200433；592493部隊(duì)醫(yī)院門(mén)診部，葫蘆島 125003

膽管癌根據(jù)膽管的解剖位置可分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌，通常確診晚，常伴有腫瘤血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后較差[1-3]，患者的5年生存率只有20%～30%[4]。目前為止，膽管癌發(fā)生和進(jìn)展的確切分子機(jī)制尚不完全清楚。RNA表觀遺傳修飾是RNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)的化學(xué)基礎(chǔ)，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物信使RNA(messenger RNA, mRNA)中含量最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾之一，約占總修飾的50%[5]，其修飾的生成依賴于甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14，METTL14)。METTL14是m6A甲基化修飾酶的重要編碼器，在多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[6]。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡調(diào)控中也起著關(guān)鍵作用[7-10]。lncRNA EIF3J反義RNA1(antisense RNA1，EIF3J-AS1)首次報(bào)道在肝細(xì)胞癌腫瘤樣本中顯著上調(diào)[11]，并且其表達(dá)異常與食管癌和結(jié)腸癌等的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)[12-13]。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA(http://gepia.cancerpku.cn/)證實(shí)METTL14與lncRNA EIF3J-AS1(lnc EIF3J-AS1)在膽管腫瘤組織中表達(dá)呈正相關(guān)，但METTL14是否直接介導(dǎo)lnc EIF3J-AS1在膽管癌腫瘤中異常表達(dá)，從而促進(jìn)膽管癌的發(fā)生仍尚未完全明確。本研究擬探討METTL14介導(dǎo)lnc EIF3J-AS1促進(jìn)膽管癌進(jìn)展的潛在分子機(jī)制。

材料與方法

一、膽管癌組織METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達(dá)檢測(cè)

收集2017年9月至2018年12月間海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外三科行手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的10例原發(fā)性膽管癌患者的癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(距離腫瘤組織邊緣>2 cm)，其中男性9例，女性1例，年齡(52±8)歲。所有樣本離體后即刻置液氮冷凍，于-80℃冰箱保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

應(yīng)用Trizol法抽提膽管癌組織及癌旁組織總RNA,采用RNA逆轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增試劑盒(日本TaKaRa公司)轉(zhuǎn)錄cDNA，再用GreenTMTB Premix Ex TaqTM(T1iRnaseH P1us，日本TaKaRa公司)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以GAPDH為內(nèi)參。METTL14正向引物序列為5′-ACTTGCTGGGTACAAGTA-3′，反向引物序列為5′-CCTTCTGATGCTTGTCTGTT-3′；lnc EIF3J-AS1正向引物序列為5′-GTCAGATTTTGTCCGTTCA-3′，反向引物序列為5′-CATGGACTTGACGTAGCTGTT-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5′-GGAGTTACTTCTATGCCTGA-3′，反向引物序列為5′-TTCATGGGGAGGTACAAC-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)儀器自帶軟件獲取Ct值，應(yīng)用 2-△△CT公式計(jì)算METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)管，取均值。

二、膽管癌組織METTL14蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用人蛋白裂解液(美國(guó)Roche公司)裂解膽管癌組織及癌旁組織，抽提總蛋白，應(yīng)用BCA法定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)METTL14蛋白表達(dá)，以actin為內(nèi)參?？筂ETTL14抗體(1∶1 000)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(ab220030)，HRP二抗(1∶3 000)購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。最后ECL發(fā)光， X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、膽管癌HUCCT1和RBE細(xì)胞METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達(dá)檢測(cè)

膽管癌細(xì)胞株HUCCT1和RBE均取自中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)復(fù)蘇及培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，分為HUCCT1對(duì)照組和HUCCT-METTL14組，RBE對(duì)照組和RBE-METTL14組。兩對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對(duì)照的慢病毒，兩METTL14組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的干擾METTL14表達(dá)的慢病毒。所有慢病毒均購(gòu)自上海吉瑪生物制藥有限公司。慢病毒轉(zhuǎn)染按慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。取上述4組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按前述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達(dá)量。

四、膽管癌HUCCT1和RBE細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)

同上法將膽管癌細(xì)胞株分為HUCCT1對(duì)照組和HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組，RBE對(duì)照組和RBE-lnc EIF3J-AS1組。兩對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對(duì)照慢病毒，兩lnc EIF3J-AS1組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的干擾lnc EIF3J-AS1表達(dá)的慢病毒。應(yīng)用Transwell小室(美國(guó)Corning公司)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。將Transwell小室隔膜上面用凝膠覆蓋后檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。將含1×105個(gè)細(xì)胞的100 μl無(wú)血清培養(yǎng)液加入Transwell小室的上室，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液500 μl，培養(yǎng)24 h后取出小室隔膜，用棉簽輕輕擦去隔膜上面未穿膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛室溫固定隔膜30 min，PBS洗3次，1.5%亞甲藍(lán)染色，室溫干燥，在顯微鏡下觀察5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算每個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

五、膽管癌HUCCT1和RBE細(xì)胞EGFR和AKT蛋白表達(dá)檢測(cè)

收集HUCCT1對(duì)照組、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組、RBE對(duì)照組、RBE-lnc EIF3J-AS1組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，裂解提取細(xì)胞總蛋白，按前述的蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表達(dá)，以actin為內(nèi)參?？笶GFR抗體(1∶1 000，ab52894)、p-AKT 抗體(1∶2 000，ab38449)、AKT抗體(1∶2 000，ab8805)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，HRP二抗(1∶3 000)購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。p-AKT、AKT蛋白表達(dá)以兩者的比值表示。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、膽管癌組織和癌旁組織METTL14、lnc EIF3J-AS1表達(dá)水平及其相關(guān)性

膽管癌組織及其癌旁正常組織METTL14 mRNA表達(dá)量分別為0.075±0.012和0.031±0.006，lnc EIF3J-AS1表達(dá)量分別為0.140±0.032和0.064±0.012，癌組織表達(dá)量均顯著高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.85、10.79，P值均<0.05)。膽管癌組織METTL14 mRNA與lnc EIF3J-AS1表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.883，P=0.0007，圖1)。

圖1 10例膽管癌組織METTL14 mRNA與lnc EIF3J-AS1表達(dá)的相關(guān)性

膽管癌組織及其癌旁正常組織METTL14蛋白表達(dá)量分別為0.354±0.131和0.187±0.183，癌組織顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.51，P=0.008，圖2)。

圖2 10例膽管癌組織和癌旁正常組織METTL14蛋白表達(dá)水平

二、抑制膽管癌細(xì)胞METTL14 mRNA表達(dá)對(duì)lnc EIF3J-AS1表達(dá)的影響

HUCCT1-METTL14組細(xì)胞METTL14 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(0.109±0.023比1.000±0.035)，RBE-METTL14組METTL14 mRNA表達(dá)水平也顯著低于對(duì)照組(0.137±0.011比1.000±0.019 )，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為8.91、12.51，P值均<0.05)。表明敲減METTL14的HUCCT1和RBE細(xì)胞株構(gòu)建成功。

HUCCT1-METTL14組細(xì)胞lnc EIF3J-AS1表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(0.217±0.020比1.000±0.052)，RBE-METTL14組lnc EIF3J-AS1表達(dá)水平也顯著低于對(duì)照組(0.149±0.066比1.000±0.045)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為8.02、11.23，P值均<0.05)。提示抑制膽管癌細(xì)胞METTL14表達(dá)可下調(diào)lnc EIF3J-AS1的表達(dá)。

三、下調(diào)lnc EIF3J-AS1表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組細(xì)胞lnc EIF3J-AS1表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(0.123±0.045比1.000±0.011)，RBE-lnc EIF3J-AS1組lnc EIF3J-AS1表達(dá)水平也顯著低于對(duì)照組(0.108±0.059比1.000±0.029)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.22、11.21，P值均<0.05)。表明敲減lnc EIF3J-AS1的HUCCT1和RBE細(xì)胞株構(gòu)建成功。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組細(xì)胞的遷移和侵襲能力均較對(duì)照組顯著下降(每高倍視野穿膜細(xì)胞數(shù)20.33±0.67比70.67±0.33，5.00±0.58比23.33±0.33)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為12.23、11.59，P值均<0.05，圖3)；RBE-lnc EIF3J-AS1組細(xì)胞遷移和侵襲能力也均較對(duì)照組顯著下降(每高倍視野穿膜細(xì)胞數(shù)12.00±0.58比25.00±2.52，22.33±0.89比43.67±0.33)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為15.12、8.66，P值均<0.05，圖3)。提示下調(diào)膽管癌細(xì)胞lnc EIF3J-AS1表達(dá)可抑制其遷移和侵襲能力。

四、下調(diào)lnc EIF3J-AS1表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞EGFR-AKT信號(hào)通路的影響

HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組EGFR蛋白表達(dá)水平和p-AKT/AKT比值均較對(duì)照組顯著降低(0.109±0.015比1.000±0.018，0.226±0.036比1.000±0.051，圖4)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為8.56、12.77，P值均<0.05)。RBE-lnc EIF3J-AS1組EGFR蛋白表達(dá)水平和p-AKT/AKT比值也均較對(duì)照組顯著降低(0.118±0.052比1.000±0.069，0.132±0.098比1.000±0.023，圖4)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.81、12.21，P值均<0.05)。提示下調(diào)膽管癌細(xì)胞lnc EIF3J-AS1可抑制其EGFR蛋白表達(dá)，抑制AKT蛋白的磷酸化。

圖3 HUCCT1對(duì)照組、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組、RBE對(duì)照組、RBE-lnc EIF3J-AS1組的遷移(3A～3D)和侵襲(3E～3H)能力(亞甲藍(lán)染色 ×400)

圖4 HUCCT1對(duì)照組(1)、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組(2)、RBE對(duì)照組(3)、RBE-lnc EIF3J-AS1組(4)膽管癌細(xì)胞EGFR、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)

討 論

m6A修飾是真核RNA中最常見(jiàn)的化學(xué)標(biāo)記，是一種可逆的表觀調(diào)控修飾[14]。這種修飾被發(fā)現(xiàn)于嵌入RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共識(shí)序列G(G>A)m6AC(U>A>C)中的腺苷，特別是在終止密碼子附近[15]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，RNA中的m6A修飾影響RNA的穩(wěn)定性和功能，并對(duì)大多數(shù)生物過(guò)程至關(guān)重要，包括組織發(fā)育、DNA損傷反應(yīng)、性別決定和腫瘤發(fā)生等[16]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物由METTL3、METTL4、METTL14、WTAP、VIRMA等組成[17]。近期研究表明，甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL4在多種實(shí)體惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，然而METTL14在膽管癌的發(fā)生和進(jìn)展中的作用在很大程度上尚不清楚[18]。本研究通過(guò)定量PCR以及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)m6A甲基化酶METTL14在膽管癌腫瘤組織中上調(diào)表達(dá)，提示METTL14可能在膽管癌的發(fā)生和進(jìn)展中扮演重要的癌基因角色。

lnc RNA在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色，其中l(wèi)nc EIF3J-AS1首次報(bào)道在肝細(xì)胞癌腫瘤樣本中顯著上調(diào)，并與肝細(xì)胞癌的無(wú)復(fù)發(fā)生存密切相關(guān)[11]。然而，其對(duì)膽管癌細(xì)胞惡性行為的潛在生物學(xué)作用尚未見(jiàn)報(bào)道，且是否受到m6A調(diào)控尚未明確。本研究證實(shí)lnc EIF3J-AS1在膽管癌腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并且與METTL14呈正相關(guān)，抑制METTL14表達(dá)可下調(diào)lnc EIF3J-AS1在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)lnc EIF3J-AS1可抑制膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，并抑制EGFR蛋白表達(dá)和Akt蛋白的磷酸化，提示METTL14可能通過(guò)上調(diào)lnc EIF3J-AS1表達(dá)在膽管癌細(xì)胞惡性行為中和EGFR-Akt信號(hào)通路調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

綜上所述， m6A甲基化酶METTL14介導(dǎo)lnc EIF3J-AS1上調(diào)表達(dá)可以促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，但本研究的隊(duì)列樣本量少，未來(lái)仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證METTL14與lnc EIF3J-AS1在膽管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及與膽管癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突