栗浩然，王雅莉，李紅娟，相元翠，劉會敏

0 引言

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者確診晚，死亡率較高，占所有癌癥死亡的5%[1]。盡管通過手術(shù)、化療等一線治療方法進行積極治療，但被診斷為Ⅲ期或Ⅳ期的卵巢癌5年生存率仍低于25%，主要原因為治療后復發(fā)并最終發(fā)展為化療耐藥[2]。因此，探究卵巢癌化療耐藥機制，尋找潛在的治療靶點成為提高卵巢癌治療效果、改善預后的關(guān)鍵。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，越來越多的研究證明，lncRNA可根據(jù)其結(jié)合的伴侶類型和數(shù)量發(fā)揮多種功能，可能在正常發(fā)育和疾病發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，可與信號通路中的分子直接相互作用而調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FAL1在胃癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中異常高表達，可促進細胞增殖、轉(zhuǎn)移和抑制細胞凋亡[5-7]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）信號通路與癌癥代謝過程之間的聯(lián)系已經(jīng)得到了廣泛研究，MAPK的激活是腫瘤發(fā)生的重要特征，MAPK在乳腺癌、肝癌、胃癌等耐藥細胞株中均呈顯著高表達狀態(tài)，抑制該信號通路的激活則能不同程度逆轉(zhuǎn)耐藥細胞的化療耐藥性[8]。目前，關(guān)于lncRNA FAL1在卵巢癌中的表達及對其化療耐藥性方面的研究尚少，其作用機制尚不清晰，因此，本研究以MAPK信號通路為切入點，構(gòu)建FAL1基因沉默SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞，觀察下調(diào)FAL1對卵巢癌細胞化療耐藥性的影響，并初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

人卵巢癌SKOV3、COC1細胞株及其順鉑耐藥細胞株SKOV3/DDP、COC1/DDP，購自中科院上海細胞庫。細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。每2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2 動物

24只SPF級6周齡雄性BALB/c裸鼠，體重18～20g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK(京)2017-0011），飼養(yǎng)于河南省實驗動物中心實驗室獨立動物房（實驗動物使用許可證號碼：SYXK（豫）2016-0002）。

1.3 試劑與儀器

順鉑（Cisplatin，DDP，美國Sigma-Aldrich公司，批號：P4394）；DMEM培養(yǎng)基，MTT染色試劑盒、Transwell小室、基質(zhì)膠、結(jié)晶紫染液、胎牛血清，青鏈霉素混合液（100×），胰蛋白酶-EDTA消化液，RIPA裂解液、PMSF、脫脂奶粉、ECL發(fā)光液、PVDF轉(zhuǎn)印膜（北京索萊寶科技有限公司）；吉姆薩染色試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；Lipofectamine2000（北京沃比森科技公司）；FAL1干擾序列FAL1-siRNA及其陰性對照NC-siRNA委托上海吉瑪公司構(gòu)建；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific公司）；引物（日本Takara公司）；MDR-1、MPR-1、ABCG2、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、GAPDH兔源單克隆抗體，羊抗兔二抗（美國CST公司）；IX53顯微鏡（日本奧林巴斯）；TGL16MB高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；G:BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)（Syngene）。

1.4 方法

1.4.1 qRT-PCR檢測卵巢癌細胞及其耐藥細胞中FAL1 mRNA表達差異 收集細胞，胰酶消化、離心后收集細胞沉淀，加入適量Trizol裂解液提取細胞總RNA，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara公司設計合成，所有樣品均以GAPDH作為內(nèi)參。反應體系：dNTPs 0.5 μl+5×Buffer 5 μl+Taq酶0.3 μl+MgCl21.5 μl+cDNA模板2 μl+上下游引物分別1 μl，加去離子水至總體積25 μl。反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸30 s，重復40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃ 5 min終止反應，實驗重復3次。采用2-△△CT的方法計算目的基因mRNA相對表達水平的變化。引物序列見表1。

1.4.2 細胞分組與轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的SKOV3/DDP、COC1/DDP細胞，接種至6孔板中，濃度為5×105個/孔。當細胞生長融合至70%～80%時，參照Lipofectamine2000試劑盒說明書，對細胞轉(zhuǎn)染NC-siRNA、FAL1-siRNA，轉(zhuǎn)染5 h后更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。通過qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后細胞中FAL1 mRNA的表達量，確定轉(zhuǎn)染是否成功，方法同1.4.1。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.4.3 MTT法檢測細胞增殖能力 收集細胞，消化、離心、重懸后計數(shù)，以3×103個/孔的濃度接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液，加入DDP濃度為0、3.13、6.25、12.5、25、50 μg/ml的含藥培養(yǎng)基，每孔100 μl，每組設置4個復孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔細胞中加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，在37℃下繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，充分振蕩混勻使結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測OD值，計算藥物的半抑制濃度（IC50），選擇小于IC50的DDP濃度（6.25 μmol/L）進行后續(xù)實驗。

1.4.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力 收集細胞，使用DDP處理48 h，消化、離心、重懸，采用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞，按照2×104個/孔的濃度接種于已鋪有基質(zhì)膠的上室，每孔200 μl，下室加入600 μl的DMEM完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，取出上室，用甲醇固定20 min，棉簽擦掉上室殘余細胞，1%的結(jié)晶紫染色15 min，PBS緩沖液沖洗2遍，置于顯微鏡下觀察，選取4個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值。

1.4.5 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆能力 收集細胞，使用DDP處理48 h，消化、離心、重懸后計數(shù)，按照1 000個/孔的濃度接種于6孔板中，每組設置3個復孔，加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)基，每3～4 d更換一次，共培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗2次，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛溶液固定細胞，30 min后吸出多聚甲醛溶液，PBS緩沖液清洗2次，加入1 ml吉姆薩A染液染色5 min，加入B染液2 ml染色15 min，PBS緩沖液清洗至6孔板無染料殘留，晾干后置顯微鏡10倍鏡下觀察，統(tǒng)計細胞數(shù)大于10個的克隆數(shù)，重復3次，取平均值。

1.4.6 Western blot法檢測細胞耐藥相關(guān)蛋白及MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達水平 采用Western blot法檢測細胞蛋白表達水平。收集細胞，胰酶消化、離心后收集細胞沉淀，加入蛋白裂解液置冰上裂解20 min，離心取上清液，BCA蛋白定量法測定蛋白的濃度，加入上樣緩沖液，EP管中混勻后置于沸水中煮沸5 min使蛋白變性。配置15%的分離膠和5%的濃縮膠，每個樣本取30 μg進行SDSPAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h。PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫下封閉2 h，隨后將條帶放入10 ml MDR-1、MPR-1、ABCG2、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、GAPDH兔源一抗蛋白稀釋液中，一抗稀釋比例為1:2 000，置于4℃冰箱中過夜，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min。37℃環(huán)境下加入羊抗兔二抗孵育2 h，二抗稀釋比例為1:1 000，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發(fā)光液，反應1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實驗的內(nèi)參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個蛋白對應的灰度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4.7 裸鼠皮下移植瘤 小鼠適應性飼養(yǎng)3天后，將已轉(zhuǎn)染NC-siRNA或FAL1-siRNA的SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞（100 μl,1×107個/毫升）注射至小鼠右前肢皮下，待腫瘤組織生長至100 mm3左右時，使用游標卡尺測量，瘤體積（mm3）=0.5×長徑×短徑2，每周測量一次瘤體積，待第4周（第28天）時測量瘤體積后處死小鼠，收集瘤組織并稱重。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Graph-Pad Prism 8.0作圖，實驗重復3次，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FAL1基因表達與卵巢癌細胞化療耐藥性的關(guān)系

不同濃度DDP處理SKOV3、COC1細胞及SKOV3/DDP、COC1/DDP細胞，細胞的增殖活力均降低，DDP對SKOV3細胞的IC50為（3.50±0.42）μg/ml，對SKOV3/DDP細胞的IC50為（15.25±1.01）μg/ml，DDP對COC1細胞的IC50為（2.15±0.22）μmol/ml，DDP對COC1/DDP細胞的IC50為（9.88±0.45）μmol/ml。見圖1。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，SKOV3、SKOV3/DDP細胞中FAL1 mRNA的表達水平分別為1.05±0.06、2.53±0.15，與SKOV3細胞比較，SKOV3/DDP細胞中FAL1基因的表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。COC1、COC1/DDP細胞中FAL1 mRNA的表達水平分別為0.89±0.09、1.96±0.13，與COC1細胞比較，COC1/DDP細胞中FAL1基因的表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖1 MTT法檢測卵巢癌細胞及其耐藥株對DDP的敏感度差異Figure 1 Differences in sensitivity of ovarian cancer cells and their drug-resistant cell lines to DDP detected by MTT

圖2 FAL1在卵巢癌細胞及其耐藥株中的表達情況Figure 2 Expression of FAL1 in ovarian cancer cells and their drug-resistant cell lines

2.2 FAL1-siRNA抑制SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞中FAL1 mRNA的表達

在SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞中，轉(zhuǎn)染NCsiRNA未改變FAL1 mRNA表達水平（P＞0.05），轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA使SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞中FAL1 mRNA表達量顯著降低（均P＜0.01），證明兩種細胞均轉(zhuǎn)染成功，見圖3。

圖3 qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中FAL1 mRNA的表達量Figure 3 Expression of FAL1 mRNA in each group after transfection detected by qRT-PCR

2.3 FAL1基因下調(diào)對SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞化療耐藥性的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，采用不同濃度的DDP處理各組細胞后，轉(zhuǎn)染NC-siRNA未改變細胞對DDP的敏感度（P＞0.05），轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA后，SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞的增殖被DDP顯著抑制（P＜0.01）。在SKOV3/DDP細胞中，DDP對照組（control）、SKOV3/DDP-FAL1-NC組和SKOV3/DDP-FAL1-siRNA組細胞的IC50分別為（15.66±1.85）μg/ml、（15.25±1.12）μg/ml和（8.24±1.05）μg/ml。在COC1/DDP細胞中，DDP對照組（Control）、COC1/DDP-FAL1-NC組和COC1/DDP-FAL1-siRNA組細胞的IC50分別為（10.02±0.59）μg/ml、（9.69±0.68）μg/ml、（4.22±0.42）μg/ml，見圖4。

2.4 FAL1基因下調(diào)對SKOV3/DDP細胞侵襲能力的影響

采用DDP處理48 h后，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NCsiRNA未改變細胞的侵襲能力（P＞0.05），轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA后，SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞的侵襲能力被DDP顯著抑制，穿膜數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖5。

圖4 FAL1基因下調(diào)對細胞化療耐藥性的影響Figure 4 Effect of FAL1 gene downregulation on cell chemotherapy resistance

2.5 FAL1基因下調(diào)對SKOV3/DDP細胞克隆能力的影響

采用DDP處理48h后，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NCsiRNA未改變細胞的克隆能力（P＞0.05），轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA后，SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞的克隆能力被DDP顯著抑制，克隆數(shù)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖6。

2.6 FAL1基因下調(diào)對細胞耐藥相關(guān)蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，一定劑量的DDP可使耐藥相關(guān)蛋白MDR-1、MPR-1、ABCG2的相對表達水平降低（P＜0.05），而與Control+DDP組比較，轉(zhuǎn)染NC-siRNA未改變耐藥相關(guān)蛋白MDR-1、MPR-1、ABCG2的相對表達水平（P＞0.05），轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA后，SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞耐藥相關(guān)蛋白MDR-1、MPR-1、ABCG2的相對表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖7。

2.7 FAL1基因下調(diào)對SKOV3/DDP細胞MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，一定劑量的DDP可使SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞p38 MAPK、ERK1/2和JNK的磷酸化水平降低（P＜0.05）。而與Control+DDP組比較，轉(zhuǎn)染NC-siRNA未改變SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞p38 MAPK、ERK1/2和JNK的磷酸化水平（P＞0.05），轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA后，SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞p38 MAPK、ERK1/2和JNK的磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖8。

2.8 FAL1基因下調(diào)對SKOV3/DDP和COC1/DDP移植瘤的影響

結(jié)果顯示，與SKOV3/DDP-FAL1-NC組或COC1/DDP-FAL1-NC組比較，轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA使SKOV3/DDP-FAL1-siRNA和COC1/DDP-FAL1-siRNA細胞皮下移植瘤體積顯著縮小（P＜0.01），見圖9。

3 討論

圖5 FAL1基因下調(diào)對SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞侵襲能力的影響 (×400)Figure 5 Effect of FAL1 gene downregulation on invasion abilities of SKOV3/DDP and COC1/DDP cells (×400)

圖6 FAL1基因下調(diào)對SKOV3/DDP和細胞克隆能力的影響Figure 6 Effect of FAL1 gene downregulation on cloning abilities of SKOV3/DDP and COC1/DDP cells

圖7 FAL1基因下調(diào)對細胞耐藥相關(guān)蛋白表達的影響Figure 7 Effect of FAL1 gene downregulation on expression of cell resistancerelated proteins

圖8 FAL1基因下調(diào)對MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Figure 8 Effect of FAL1 gene downregulation on expression of proteins related to MAPK signaling pathway

圖9 下調(diào)FAL-1對SKOV3/DDP和COC1/DDP皮下移植瘤的影響Figure 9 Effect of FAL-1 downregulation on SKOV3/DDP and COC1/DDP subcutaneous transplantation tumor

人類基因組中所包含的具有編碼蛋白質(zhì)功能的基因約20 000個，僅占整個基因組的1.5%左右，其余的基因被稱為非編碼RNA[9]。ncRNA最初被認為是基因組轉(zhuǎn)錄“噪音”，隨著研究不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)無論是長鏈或是短鏈ncRNA，均對多種人類疾病具有調(diào)控作用[10-12]。研究證明，卵巢癌中存在異常表達的長鏈非編碼RNA（lncRNAs），其中某些lncRNAs已被證實可通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲過程發(fā)揮抗癌或促癌作用[13-14]。1號染色體上局部擴增的lncRNA FAL1是一種具有增強子樣活性的新型lncRNA，已被確定為多種癌癥的致癌基因，能夠促進癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而FAL1的高表達水平也通常預示著惡性腫瘤患者預后不良[15]。

雖然Zhang等[16]指出FAL1在卵巢癌中呈高表達狀態(tài)，但FAL1與卵巢癌化療耐藥性的關(guān)系及其作用機制尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)卵巢癌耐順鉑細胞株SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞對順鉑的敏感度顯著低于其親本細胞株，而FAL1基因的表達水平顯著高于其親本細胞株，初步證實了lncRNA FAL1的高表達狀態(tài)與卵巢癌細胞呈現(xiàn)化療耐藥性有關(guān)，而下調(diào)FAL1基因則顯著降低了細胞的增殖、侵襲和克隆能力，表明沉默F(xiàn)AL1基因可以顯著降低卵巢癌耐藥細胞的生物學功能，提高其對化療藥物的敏感度。研究表明，ATP結(jié)合盒（ABC）外排蛋白家族，尤其是MDR-1、MPR-1、ABCG2的表達可賦予腫瘤細胞對細胞毒性藥物和靶向化療的耐藥性[17]。Eid等[18]研究表明，抑制ABCC1，ABCG2和ABCB1等多藥耐藥蛋白的表達可誘導細胞凋亡，減少耐藥性的產(chǎn)生。與上述研究一致，在本研究中，轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA使細胞中耐藥相關(guān)蛋白MDR-1、MPR-1、ABCG2的表達水平顯著降低，細胞對DDP的敏感度增加，進一步證明lncRNA FAL1的高表達狀態(tài)誘導了卵巢癌細胞的化療耐藥性，沉默F(xiàn)AL1基因則可顯著抑制卵巢癌細胞化療耐藥性的產(chǎn)生。MAPK信號通路是人類癌癥中最常見的突變信號轉(zhuǎn)導途徑，靶向MAPK途徑的治療長期以來被認為是一種具有良好應用前景的癌癥治療策略，靶向作用于p38 MAPK、ERK、JNK等MAPK途徑關(guān)鍵基因可以抑制干擾細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等活動，針對該信號通路的抑制劑ulixertinib在臨床試驗中表現(xiàn)出對晚期實體瘤有較好的治療效果和良好的藥動學過程[19-20]。Tang等[21]研究表明，激活MAPK途徑可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，并抑制細胞凋亡。與上述研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AL1基因高表達的SKOV3/DDP和COC1/DDP細胞中，p38 MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平較高，使用DDP處理后，p38 MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平降低，而下調(diào)FAL1基因可使耐藥細胞中p38 MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平顯著降低，表明lncRNA FAL1可能通過激活MAPK信號通路促進卵巢癌SKOV3細胞產(chǎn)生化療耐藥性，沉默F(xiàn)AL1基因則可顯著抑制MAPK信號通路的活化。

綜上所述，沉默F(xiàn)AL1基因可顯著降低卵巢癌耐順鉑細胞株的化療耐藥性，抑制耐藥細胞在體內(nèi)的增殖能力，其作用機制與抑制MAPK信號通路的活化有關(guān)。然而，LncRNA調(diào)控方式有多種，本研究僅在動物和細胞水平進行了初步探討，其具體作用機制仍需更多研究加以驗證。