包針 白雯 王姣 楊玉春 劉志強(qiáng) 何鵬義 木胡牙提

免疫反應(yīng)是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),尤其是T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)。程序性死亡受體-1(PD-1)被認(rèn)為在T 細(xì)胞反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用,目前在惡性腫瘤、自身免疫性疾病中得到了廣泛研究。有研究指出PD-1 或PD-1配體(PD-L1)的下調(diào)均可導(dǎo)致小鼠心肌的自身免疫損傷,甚至誘發(fā)致死性心肌炎[1]。PD-L1的基因缺失,以及PD-L1阻抗劑的治療,會(huì)加劇心臟的炎癥反應(yīng)[2],表明PD-1/PDL1信號(hào)通路介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)心肌免疫應(yīng)答有重要的影響。目前心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,大量研究表明房顫患者血漿中的免疫炎性標(biāo)志物較健康個(gè)體明顯升高[3],提示免疫反應(yīng)參與了房顫的發(fā)生與發(fā)展。筆者通過(guò)觀察房顫患者PD-1在CD4＋T、CD8＋T 細(xì)胞的表達(dá),探討PD-1/PD-L1信號(hào)通路在房顫中的可能機(jī)制,為房顫的防治提供新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年5月至2018年12月間新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心住院人群,按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)入選研究對(duì)象,非瓣膜性房顫患者為房顫組,其中漢族房顫50例(漢族房顫組),哈薩克族房顫50例(哈薩克族房顫組);同時(shí)選擇同期住院的非房顫患者作為對(duì)照組,漢族對(duì)照50例(漢族對(duì)照組),哈薩克族對(duì)照50例(哈薩克族對(duì)照組)。

納入標(biāo)準(zhǔn):房顫組為有明確房顫病史和(或)心電圖/動(dòng)態(tài)心電圖有明確房顫心律的漢族和哈薩克族房顫患者;對(duì)照組為無(wú)房顫病史,且入院后經(jīng)心電圖/動(dòng)態(tài)心電圖排查無(wú)房顫心律的漢族和哈薩克族非房顫患者。

排除標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病史詢問(wèn)、心臟超聲、血液生物化學(xué)檢查排除心臟瓣膜病、先天性心臟病、房顫家族史、肝腎功能不全、1個(gè)月內(nèi)有外傷或炎癥疾病史、風(fēng)濕免疫性疾病、惡性腫瘤、近1年內(nèi)因其他疾病接受過(guò)免疫抑制劑治療。

1.2 樣本收集 采集所納入研究對(duì)象的血液樣本,采血前空腹8 h,入院后隔日清晨每例采集3 ml靜脈血液,經(jīng)處理后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)研究對(duì)象外周血中CD4＋和CD8＋T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 的表達(dá)水平。

1.3 檢測(cè)方法 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞:取新鮮抗凝血1 ml,與生理鹽水1∶1混勻后,在液面上加入2 ml外周血淋巴細(xì)胞分離液;以1 500 rpm 離心20 min,取第二層環(huán)狀乳白色層為淋巴細(xì)胞,將收集的細(xì)胞放入含生理鹽水4～5 ml的試管中,充分混勻,以1 500 rpm/min離心20 min,沉淀用無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次。然后用RPMI 1640 培養(yǎng)基重新懸浮,調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/ml。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):取流式試管4支,2支分別設(shè)為抗體對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照組,1支加入熒光抗體CD3 PERCP-CY5.5(560835,BD Pharmingen)、CD4 FITC(561842,BD Pharmingen)、PD-1 PE(560795,BD Pharmingen)各20 ul;1 支加入熒光抗體CD3 PERCP-CY5.5、CD8 FITC(561947,BD Pharmingen)、PD-1 PE 各20 ul;混勻后室溫避光孵育15 min,流式洗液洗滌三次后上流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD流式細(xì)胞儀,型號(hào):FACSAria II)檢測(cè)PD-1 陽(yáng)性率,結(jié)果用CellQuest軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以(±s)表示,符合正態(tài)分布的資料,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較方差齊時(shí)采用單因素方差分析,方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn),多組間兩兩比較采用Bonferroni法調(diào)整P值,統(tǒng)計(jì)圖使用GraphPad Prism 7完成。以P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般臨床資料分析 同民族的房顫組與對(duì)照組年齡、性別、高血壓、糖尿病、冠心病分布無(wú)差異,漢族與哈薩克族房顫組的左房?jī)?nèi)徑均大于同民族對(duì)照組。見(jiàn)表1。

2.2 CD4＋T、CD8＋T 淋巴細(xì)胞PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率 漢族房顫組、哈薩克族房顫組CD4＋T 淋巴細(xì)胞PD-1的陽(yáng)性表達(dá)水平均低于同民族對(duì)照組;哈薩克族對(duì)照組CD4＋T 淋巴細(xì)胞PD-1的陽(yáng)性表達(dá)水平高于漢族對(duì)照組。漢族、哈薩克族對(duì)照組和房顫組CD8＋T淋巴細(xì)胞上PD-1的陽(yáng)性表達(dá)水平無(wú)顯著差異,哈薩克族人群中CD8＋T 淋巴細(xì)胞上PD-1的陽(yáng)性表達(dá)水平高于漢族人群。見(jiàn)圖1、2、表2。

在不區(qū)分民族的統(tǒng)計(jì)分析中,對(duì)照組CD4＋T淋巴細(xì)胞上PD-1的陽(yáng)性表達(dá)水平高于房顫組(12.71±4.81 vs 7.12±3.32,P＜0.01),兩組間CD8＋T淋巴細(xì)胞上PD-1的陽(yáng)性表達(dá)水平無(wú)顯著差異(4.23±2.31 vs 3.81±2.04,P＞0.05)。

表1 四級(jí)一般臨床資料比較

圖1 PD-1在各組患者外周血CD4＋T 淋巴細(xì)胞表面的陽(yáng)性表達(dá)率

圖2 PD-1在各組患者外周血CD8＋T 淋巴細(xì)胞表面的陽(yáng)性表達(dá)率

表2 四組外周血CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)

3 討論

PD-1是CD28免疫調(diào)節(jié)分子家族的一員,可被誘導(dǎo)表達(dá)于T 細(xì)胞表面,激活T 細(xì)胞上的抑制受體,向T 細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)是激活初始T 細(xì)胞功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞,在啟動(dòng)、調(diào)控及維持特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[4]。在外周器官中DC 細(xì)胞表面的PDL1與CD4＋、CD8＋T 細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合后,可抑制T 細(xì)胞活化、增殖,阻礙免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)T 細(xì)胞衰竭,甚至凋亡[5],在誘導(dǎo)和維持自身免疫耐受中起著關(guān)鍵作用。此外,PD-1 還通過(guò)與DC 細(xì)胞表面PD-L1結(jié)合而向DC 細(xì)胞傳遞反向信號(hào),使DC 細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10 增加,從而介導(dǎo)DC成熟障礙并抑制DC細(xì)胞的抗原遞呈功能[6]。實(shí)體腫瘤利用PD-1/PD-L1信號(hào)通路介導(dǎo)的抑制途徑,減弱抗腫瘤免疫,逃避免疫系統(tǒng)的破壞,從而促進(jìn)腫瘤的生存[7]。

在本研究中,漢族、哈薩克族房顫組CD4＋T 淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平低于同民族的對(duì)照組,且在總房顫組中CD4＋T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平低于對(duì)照組,表明在房顫患者體內(nèi)PD-1的表達(dá)是下調(diào)。Cochain等[8]以PD-1-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)組的研究發(fā)現(xiàn),PD-1 的缺失可顯著上調(diào)小鼠CD4＋T 和CD8＋T的表達(dá),同時(shí)表現(xiàn)出更為顯著的T細(xì)胞活化。有研究通過(guò)建立依賴CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞介導(dǎo)的心肌炎模型中發(fā)現(xiàn),PD-1缺陷小鼠心肌炎癥程度增加,心肌損傷的血清標(biāo)志物增加,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加[9]。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)在心肌細(xì)胞中PD-1也能通過(guò)抑制T細(xì)胞活化,降低組織中的免疫反應(yīng)。相反,PD-1表達(dá)的下調(diào)減弱了對(duì)心肌組織中T 細(xì)胞活化的抑制作用,進(jìn)而增加心肌細(xì)胞的免疫反應(yīng)并發(fā)生心肌細(xì)胞的損傷,這提示PD-1對(duì)保護(hù)心臟免受T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷的重要性。因此,PD-1可能是通過(guò)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞介導(dǎo)的心肌細(xì)胞免疫損傷,導(dǎo)致心肌炎癥增加,參與房顫的發(fā)生。在本研究中,房顫組CD8＋T 淋巴細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組相比無(wú)差別。此外,CD4＋T 細(xì)胞上PD-1 陽(yáng)性的表達(dá)率明顯高于CD8＋T細(xì)胞。這可能是由于T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在不同的炎癥反應(yīng)通路并不完全相同,例如PD-1在結(jié)核分枝桿菌感染的特異性CD4＋T 細(xì)胞上的表達(dá),而不是CD8＋T 細(xì)胞[10]。因此考慮在房顫患者中免疫應(yīng)答主要以CD4＋T細(xì)胞為主。

我國(guó)哈薩克族人群的房顫患病率低于全國(guó)平均水平,考慮與哈薩克族的飲食習(xí)慣所致低尿酸水平及民族間的差異相關(guān)[11]。本研究中對(duì)比了漢族與哈薩克族人群中房顫組與對(duì)照組T 細(xì)胞表面PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率的差異發(fā)現(xiàn):哈薩克族人群CD4＋T、CD8＋T 淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)均高于漢族人群。提示哈薩克族人群PD-1/PD-L1信號(hào)通路存在上調(diào),這可能是哈薩克族較低的房顫患病率的潛在機(jī)制。在腫瘤細(xì)胞中,PD-1/PD-L1 信號(hào)通路通過(guò)作用于下游的酪氨酸磷酸酶(SHP1/2)[12],使其對(duì)下游靶分子發(fā)揮去磷酸化作用,下調(diào)PI3K-AKT、MAPK 信號(hào)通路,促進(jìn)T 細(xì)胞的衰竭、凋亡[13－14]。目前阻斷PD-1/PD-L1通路的靶向藥物已用于治療依賴T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的腫瘤,并且取得了一定的效果[15－16]。房顫人群中PD-1/PD-L1 信號(hào)通路是否具有相同的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究證實(shí),但通過(guò)本研究可以確定的是,房顫患者體內(nèi)PD-1 的表達(dá)相對(duì)于健康人群是下調(diào)的,并且在一定程度上可以解釋哈薩克族較低的房顫患病率。