許 霞, 李 婷, 賈金茹, 湯慧婷, 李 軍, 趙云芳, 宋月林

(北京中醫(yī)藥大學(xué), 中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心, 北京 100029)

中藥毛前胡(Ligustici Radix)為傘形科植物短片藁本(LigusticumbrachylobumFranch.)的干燥根,其性溫,味甘、辛,入肝、脾、膀胱三經(jīng),主要用于治療風(fēng)熱咳嗽痰多、痰熱喘滿、咯痰黃稠等證[1]。毛前胡植物形狀、功能主治與中藥前胡(Peucedani Radix)均相似,常被用作前胡的替代品,但因其根莖部密布較為堅(jiān)硬的殘存葉鞘纖維,難以除凈,故藥材稱為毛前胡。國內(nèi)外對其化學(xué)成分研究較少,制約了毛前胡的深度開發(fā)。因此,本研究對其化學(xué)成分進(jìn)行深入闡明,以期為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù),同時(shí)也為其他傘形科中藥中香豆素類成分分析提供借鑒。利用課題組前期[2-4]建立的中心切割非手性-手性二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(heart-cutting achiral-chiral 2D LC-MS/MS)以及直接進(jìn)樣-三維質(zhì)譜法(DI-3D MS)對前胡和毛前胡的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的對比分析,通過比較各信號(hào)峰的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和保留時(shí)間,發(fā)現(xiàn)毛前胡的主要化學(xué)成分與前胡類似,均以順式角型吡喃香豆素(即為順式凱琳內(nèi)酯衍生物)為主,且含有多組對映異構(gòu)體。對前胡而言,多對對映異構(gòu)體之間的含量差異性大,表現(xiàn)為對映異構(gòu)體過量的現(xiàn)象[5],并且對映異構(gòu)體間往往呈現(xiàn)出藥理活性[6]和代謝[7]差異。我們推測毛前胡中的這些對映異構(gòu)體也并非以外消旋體的形式存在,而是其中一種構(gòu)型含量較高,通常稱為優(yōu)映體。因此,在對中藥毛前胡進(jìn)行化學(xué)成分深入分析時(shí),應(yīng)對其對映異構(gòu)體進(jìn)行立體選擇性分離,明確對映體之間的含量比例,從而更好地實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制。

近年來,一些新興的色譜填料技術(shù)例如核-殼顆粒[8]、亞微米顆粒[9,10]和整體柱[11,12],使得LC的分離能力得到了顯著提高,尤其是核-殼色譜柱因其具有更高的柱效、更低的反壓以及更高的分析效率,為中藥中結(jié)構(gòu)類似物和非對映異構(gòu)體的化學(xué)選擇性分離提供了保障。手性色譜柱快速發(fā)展,多種涂敷型、鍵合型手性色譜填料[13]的不斷涌現(xiàn)使得絕大多數(shù)對映異構(gòu)體都可以實(shí)現(xiàn)立體選擇性分離。然而,手性色譜柱往往具有較差的化學(xué)選擇性分離能力[13],而RP-C18色譜柱雖然具有高效的化學(xué)選擇性分離能力,但無法實(shí)現(xiàn)對映異構(gòu)體的手性分離。

本研究將反相非手性色譜柱和手性色譜柱通過聚醚醚酮管線在線連接,該系統(tǒng)結(jié)合了RP-C18色譜柱的高效化學(xué)選擇性分離能力和手性色譜柱的立體選擇性優(yōu)勢,有效避免中心切割非手性-手性二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的缺點(diǎn),以期同步實(shí)現(xiàn)中藥毛前胡化學(xué)成分的化學(xué)選擇性和立體選擇性分離。同時(shí),充分利用類似中藥(如前胡等)化學(xué)成分研究成果[2],進(jìn)而采用三重四極桿質(zhì)譜特有的預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測(predictive MRM)模式[14-16]實(shí)現(xiàn)化學(xué)成分的高靈敏度、高選擇性分析。利用該系統(tǒng)從中藥毛前胡中鑒定了其中60個(gè)化學(xué)成分,包括4個(gè)氨基酸類(AAs)、43個(gè)角型吡喃香豆素類(APs)、10個(gè)線型呋喃香豆素類(LFs)、2個(gè)線型吡喃香豆素類(LPs)以及1個(gè)簡單香豆素類(SC)化合物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

U-3000雙三元色譜儀,配備兩個(gè)三元泵(即左泵和右泵)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和紫外檢測器(美國Thermo Fisher公司); SCIEX 5500 Qtrap質(zhì)譜儀(美國Sciex公司); Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)(美國Millipore公司); Mettler ME204型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);超聲波清洗器(南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司); Premixer Assy混合器(日本Shimadzu公司)。

色譜級(jí)和質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈以及質(zhì)譜級(jí)甲酸均購自美國Thermo Fisher公司;實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備;其余試劑均為分析純,由北京化工廠提供。中藥毛前胡購于北京同仁堂,經(jīng)北京大學(xué)屠鵬飛教授鑒定為傘形科植物短片藁本LigusticumbrachylobumFranch.的干燥根。標(biāo)本存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理

取干燥的毛前胡藥材,粉碎機(jī)粉碎,過20目篩。精密稱取1.0 g粉末樣品,置具塞錐形瓶中,加入70%(v/v)甲醇水溶液50.0 mL,密塞,超聲提取30 min,放冷再次稱重,用70%(v/v)甲醇水溶液補(bǔ)足失重,以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液500 μL,待測。

圖 1 非手性-手性液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)構(gòu)建示意圖Fig. 1 Connectivity sketch of achiral-chiral LC-MS/MS platform Solvent A: 0.1% formic acid aqueous solution; solvent B: acetonitrile.

1.2.2液相色譜條件

Achiral-chiral LC-MS/MS系統(tǒng)各模塊連接示意圖如圖1所示。使用聚醚醚酮管將非手性柱和手性柱在線連接,利用Premixer Assy混合器將非手性柱洗脫液與左泵流動(dòng)相充分混合。非手性色譜柱:Capcell core RP-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm,日本Shiseido公司);手性色譜柱:AD-RH色譜柱(150×4.6 mm, 5.0 μm,日本Daicel公司)。右泵輸送溶劑A(0.1%(v/v)甲酸水溶液)和溶劑B(乙腈),梯度洗脫程序?yàn)?0～4.0 min, 10%B; 4.0～15.0 min, 10%B～25%B; 15.0～23.0 min, 25%B～50%B; 23.0～28.0 min, 50%B～57%B; 28.0～34.0 min, 57%B～67%B; 34.0～44.0 min, 67%B～68%B; 44.0～56.0 min, 68%B; 56.0～60.0 min, 68%B～95%B; 60.0～60.1 min, 95%B～10%B; 60.1～66.0 min, 10%B;總流速為0.3 mL/min。左泵輸送溶劑A和溶劑B,梯度洗脫程序?yàn)?0～4.0 min, 95%B～86%B; 4.0～15.0 min, 86%B～70%B; 15.0～23.0 min, 70%B～50%B; 23.0～28.0 min, 50%B～47%B; 28.0～34.0 min, 47%B～43%B; 34.0～44.0 min, 43%B～42%B; 44.0～56.0 min, 42%B; 56.0～60.0 min, 42%B～21%B; 60.0～60.1 min, 21%B～95%B; 60.1～66.0 min, 95%B;總流速為0.7 mL/min。進(jìn)樣體積為3 μL,色譜柱均置于35 ℃柱溫箱中。

1.2.3質(zhì)譜條件

手性色譜柱洗脫液直接導(dǎo)入三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行分析。電噴霧電離(ESI)源,正離子模式,預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測各化學(xué)成分。電噴霧電壓:5 500 V;離子化溫度:550 ℃;霧化氣壓力(GS1): 379.2 kPa;輔助氣壓力(GS2): 379.2 kPa;氣簾氣壓力(CUR): 241.3 kPa。Q1和Q3均為單位分辨率(0.6～0.8 Da)。預(yù)測離子對(Q1>Q3)及相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)(脫簇電壓(DP)和碰撞能(CE))如表1所示,每個(gè)離子對的采集時(shí)間(dwell time)為10 ms。

由于對映異構(gòu)體質(zhì)譜行為完全一致,因此本研究對于每個(gè)化合物均采用兩對離子對進(jìn)行檢測,并利用定量和定性離子對豐度比值(QQR)判定兩個(gè)色譜信號(hào)是否為對映異構(gòu)體[23,24]。利用數(shù)據(jù)依賴性采集模式觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描(EPI)模式記錄各母離子的MS2圖譜。EPI實(shí)驗(yàn)參數(shù)為:CE, 40 eV;碰撞能量分散(CES), 35 eV。利用Analyst 1.6.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相條件的優(yōu)化

課題組前期在建立反相色譜和親水作用色譜直接耦聯(lián)系統(tǒng)[25,26]時(shí)發(fā)現(xiàn),通過選擇內(nèi)徑小、柱效高的反相色譜柱作為前端色譜柱可以達(dá)到較好的分離效果。本實(shí)驗(yàn)篩選并考察了多個(gè)候選色譜柱,如ACE UltraCore 2.5 Super C18(150 mm×2.1 mm, 2.5 μm,英國Advance Chromatography Technologies公司)、Waters Acquity UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Waters公司)、Ascentis?Express F5 (150 mm×3.0 mm, 2.7 μm,美國Sigma-Aldrich公司)、Capcell core RP-C18(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm,日本Shiseido公司)等多款核殼型或新型填料高效色譜柱,以色譜峰形、分離度作為指標(biāo)衡量色譜柱的分離效能,最終選擇Capcell core RP-C18色譜柱作為前端化學(xué)選擇性分離柱。

進(jìn)一步優(yōu)化非手性柱流動(dòng)相流速(0.15、0.20、0.30和0.35 mL/min)和手性柱流動(dòng)相流速(0.60、0.70和0.80 mL/min)、流動(dòng)相的洗脫程序以及在水中加入甲酸的體積分?jǐn)?shù)(0%、0.05%、0.10%和0.15%)。最終選定0.1%甲酸作為水相的添加劑；非手性柱和手性柱的流速分別為0.3 mL/min和0.7 mL/min；具體洗脫程序見1.2.2節(jié)。

前期研究表明,AD-RH色譜柱[3,7,27]對APs對映異構(gòu)體有較好的分離效果,其反相分離機(jī)制與前端色譜柱能夠很好地兼容。在APs中,C-3′和C-4′取代基團(tuán)的大小會(huì)影響對映異構(gòu)體的分離效能,且取代基團(tuán)越大,分離效果越差,需要采用較低比例的有機(jī)相和較長的洗脫時(shí)間才能達(dá)到較好的分離。因此,在洗脫過程中逐步降低流動(dòng)相的比例,且在RP-C18和AD-RH色譜柱之間引入稀釋泵,可以對含有大取代基團(tuán)的對映異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)良好的色譜分離。對映異構(gòu)體在AD-RH手性色譜柱上的流出順序決定于手性中心與表面涂敷有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅膠之間的作用力[28]。課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn),(3′S,4′S)構(gòu)型的對映異構(gòu)體與固定相的作用力小于其(3′R,4′R)對映異構(gòu)體,其被率先洗脫出來。因此,毛前胡中具有較小保留時(shí)間的對映異構(gòu)體構(gòu)型被認(rèn)為是(3′S,4′S)構(gòu)型,為了表述方便,以下簡稱為3′S構(gòu)型。

2.2 多反應(yīng)監(jiān)測模式的條件優(yōu)化

結(jié)合已經(jīng)報(bào)道[29]的質(zhì)譜裂解規(guī)律及MRM離子對信息,筆者首先對預(yù)測離子對的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)而采用預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測各化學(xué)成分,并利用EPI模式獲取化合物的二級(jí)質(zhì)譜信息,結(jié)合碎片離子對化合物進(jìn)行鑒定。前期研究[2]表明,毛前胡中所含的化學(xué)成分與前胡相似,不同成分的含量差異大,其中含量較高的APs可能會(huì)影響微量化合物的檢出。因此,本實(shí)驗(yàn)引入在線能量分辨質(zhì)譜法[30,31]對各化合物的碰撞能進(jìn)行優(yōu)化,采用非最優(yōu)碰撞能抑制高含量成分的質(zhì)譜響應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)所有化合物的檢出。

2.3 對映體異構(gòu)體判別

實(shí)驗(yàn)通過QQR判定是否為對映異構(gòu)體[23,24],結(jié)合對映異構(gòu)體在achiral-chiral LC系統(tǒng)上的保留時(shí)間大于在單柱RP-C18色譜柱上的保留時(shí)間,經(jīng)過驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)順式-凱琳內(nèi)酯(CKL, 7和8(表1中化合物的順序編號(hào)))、前胡香豆素G(QC-G, 10和11)、順式-北美芹素(Pte, 35和43)、白花前胡甲素(PA, 37和44)、順式-3′-異戊酰-4′-乙酰凱琳內(nèi)酯(IAK, 42和46)、白花前胡乙素(PB, 52和54)、白花前胡素E (PE, 55和56)和順式-3′,4′-雙異戊酰凱琳內(nèi)酯(DIK, 57和58)共計(jì)8對對映異構(gòu)體,所有對映異構(gòu)體在非手性-手性色譜耦聯(lián)系統(tǒng)上均能較好地手性分離(見圖2),除前胡香豆素G為LFs外,其余均為APs。如化合物順式-北美芹素(35和43)為CKL的衍生物,在角型吡喃香豆素母核的C-3′和C-4′分別為乙酰基和當(dāng)歸?；〈?分子式為C21H22O7,預(yù)測離子對包括m/z409.12>327.12、409.12>287.09、409.12>245.07、409.12>227.07,利用數(shù)據(jù)依賴性采集模式觸發(fā)EPI,獲取母離子的二級(jí)質(zhì)譜信息,驗(yàn)證化合物的結(jié)構(gòu)。選擇m/z409.12>227.07和409.12>245.07作為定量離子對和定性離子對,化合物L(fēng)-Pte和D-Pte的QQR均為2.36,根據(jù)兩者的保留時(shí)間,鑒定L-Pte和D-Pte分別為3′S和3′R構(gòu)型?；衔镯樖?北美芹素的疊加選擇離子流圖和二級(jí)質(zhì)譜圖如圖3a和3b所示。

表 1 中藥毛前胡化學(xué)成分在非手性-手性色譜-預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測系統(tǒng)上的質(zhì)譜信息

表 1 (續(xù))

圖 2 采用(a)非手性色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和(b)非手性-手性色譜-串聯(lián)質(zhì)譜時(shí)毛前胡的選擇離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of Ligustici Radix using (a) achiral LC-MS/MS and (b) achiral-chiral LC-MS/MSPeaks 1-60 are the same as that in Table 1.

圖 3 順式-北美芹素的(a)疊加選擇離子流色譜圖和(b)二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 3 (a) Overlaid extracted ion current chromatograms and (b) MS2 spectrum of pteryxin

2.4 毛前胡結(jié)構(gòu)鑒定及質(zhì)譜裂解規(guī)律

2.4.1化學(xué)成分定性分析

圖 4 白花前胡甲素的(a)質(zhì)譜圖和(b)可能的裂解途徑Fig. 4 (a) MS spectrum and (b) proposed fragmentation pathways of PA

利用建立的非手性-手性色譜-預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測系統(tǒng)采集毛前胡在正離子模式下的質(zhì)譜信息,結(jié)合碎片離子信息、文獻(xiàn)對比、數(shù)據(jù)庫搜索以及質(zhì)譜裂解規(guī)律推導(dǎo),對所有響應(yīng)值大于1 000 cps,且信噪比(S/N)大于100的信號(hào)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn),初步鑒定了其中60個(gè)化學(xué)成分,包括4個(gè)AAs、43個(gè)APs、10個(gè)LFs、2個(gè)LPs以及1個(gè)SC化合物。各化合物的保留時(shí)間、主要碎片離子、預(yù)測離子對以及可能的化學(xué)成分見表1。

在正離子模式下,香豆素類化合物易產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+或加合離子峰[M+Na]+及[M+NH4]+。APs主要為順式凱琳內(nèi)酯的衍生物,大部分APs通過C-3′和C-4′的羥基結(jié)合不同的取代基形成不同的化合物,常見的取代基有乙?；?、當(dāng)歸?；?、巴豆酰基、千里光酰基、正丁酰基、異戊?；取τ贚Fs來說,主要通過C-5和C-8或C-3′和C-4′上取代基的不同,形成不同的化合物,如異戊烷氧基、甲氧基、糖基等。以下對毛前胡中的主要化學(xué)類型的質(zhì)譜裂解規(guī)律以及各化學(xué)成分的鑒定過程進(jìn)行分述。

2.4.2角型吡喃香豆素類

從毛前胡提取物中共鑒定出43個(gè)APs成分,大部分為順式凱琳內(nèi)酯的衍生物。對于APs來說,C-4′取代基處于香豆素母核的芐位,可與香豆素母核形成大的共軛體系,得到更穩(wěn)定的子離子。通過丟失C-3′和C-4′位的取代基,形成m/z245.07特征性碎片離子,并進(jìn)一步通過中性丟失水分子形成另一個(gè)m/z227.07特征性碎片離子。例如,PA在C-3′和C-4′位置分別有一個(gè)當(dāng)歸?；鸵阴Ｑ趸〈?分子式為C21H22O7,最顯著的準(zhǔn)分子離子峰為m/z409.12 [M+Na]+?；衔锪呀鈺r(shí),首先從C-4′中性丟失一分子乙酰氧基(60 Da),形成豐度最高的碎片離子m/z327.12 [M+H-CH3COONa]+、進(jìn)而丟失C-3′取代基(C4H6CO, 82 Da),形成特征碎片離子m/z245.08 [M+H-CH3COOH-C4H6-CO]+,隨后進(jìn)一步中性丟失一分子水,最終形成m/z227.07 [M+H-CH3COOH-C4H7COOH]+的特征碎片離子。PA的質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑如圖4所示。

2.4.3線型呋喃香豆素類

除APs外,毛前胡中還含有少量的LFs化學(xué)成分,其中包括一對對映異構(gòu)體QC-G (10和11)。質(zhì)譜裂解規(guī)律主要由C-5、C-8或C-3′、C-4′取代基的不同而產(chǎn)生,常見的取代基有異戊烷氧基、甲氧基、羥基、糖基等。

C-5或C-8取代基首先通過中性丟失形成m/z203.05碎片離子,隨后進(jìn)一步中性丟失CO (28 Da)和CO2(44 Da),分別產(chǎn)生m/z175.04和159.03的特征性碎片離子[21]。C-3′或C-4′取代的化合物,通過中性丟失C-3′或C-4′上的取代基,形成m/z247.08和229.20的特征性碎片離子[19]。如紫花前胡苷,準(zhǔn)分子離子峰m/z409.08 [M+H]+,分子式為C20H24O9, C-3′有葡萄糖基取代,中性丟失一分子葡萄糖殘基,產(chǎn)生m/z247.08 [M+H-C6H10O5]+的碎片離子,隨后,進(jìn)一步丟失一分子水,形成m/z229.20 [M+H-C6H10O5-H2O]+的特征性離子。紫花前胡苷質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑如圖5所示。

圖 5 紫花前胡苷的(a)質(zhì)譜圖和(b)可能的裂解途徑Fig. 5 (a) MS spectrum and (b) proposed fragmentation pathways of nodakenin

2.5 非手性-手性色譜-預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測法優(yōu)缺點(diǎn)

非手性-手性色譜耦聯(lián)系統(tǒng)結(jié)合了RP-C18的高效分離能力以及手性色譜柱的立體選擇性優(yōu)勢,可以同步實(shí)現(xiàn)化合物的化學(xué)選擇性和立體選擇性分離。相比較于中心切割非手性-手性二維液相色譜而言,非手性-手性色譜耦聯(lián)系統(tǒng)具有儀器配置簡單、重復(fù)性好、精密度高的優(yōu)點(diǎn)。然而,該系統(tǒng)也存在一定的缺點(diǎn),如分離機(jī)制復(fù)雜,因?yàn)槊總€(gè)化合物都要經(jīng)歷2個(gè)色譜柱;尋找最佳的洗脫條件是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù),因?yàn)檩斔腿軇┳钌傩枰?個(gè)泵;二維色譜柱的要求高,要兼顧一維色譜柱的洗脫能力等。

3 結(jié)論

中藥中廣泛存在對映異構(gòu)體,這些對映異構(gòu)體往往具有不同的生物活性,從而發(fā)揮不同的治療效果。全面闡明中藥的化學(xué)成分組成,深入揭示對映異構(gòu)體的含量差別將會(huì)使藥物更好地發(fā)揮藥理活性。本研究建立了非手性-手性色譜-預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測法,實(shí)現(xiàn)了中藥毛前胡的化學(xué)成分解析,揭示了其對映異構(gòu)體的含量差異。本研究將為含有對映異構(gòu)體的中藥及其他復(fù)雜樣品的深入定性、定量分析提供可靠的方法。