王許欣, 周澍堃, 李曉敏, 張慶合

(中國計量科學(xué)研究院化學(xué)計量與分析科學(xué)研究所, 北京 100029)

福美雙(thiram)是重要的二硫代氨基甲酸酯(DTC)殺菌劑,DTC包括二甲基二硫代氨基甲酸酯(DMDs)、乙撐二硫代氨基甲酸酯(EBDs)和丙撐二硫代氨基甲酸酯(PBDs)[1]。福美雙是二甲基二硫代氨基甲酸的氧化產(chǎn)物,是一種無金屬殺菌劑。福美雙可用作種子保護(hù)劑,用于水果、蔬菜、觀賞植物和草坪作物的葉面處理,以控制真菌病害的數(shù)量,并保護(hù)收獲的作物在儲存或運(yùn)輸過程中不變質(zhì)[2]。美國環(huán)境保護(hù)署法規(guī)(EPA-HQ-OPP-2009-0431-0001)和歐盟(EC) No 396/2005(《歐盟植物源和動物源食品及飼料中的農(nóng)藥最大殘留限量》)均對福美雙進(jìn)行了限量規(guī)定,涉及食品基體主要是水果和蔬菜,限量范圍為0.1～15 mg/kg,對谷物沒有給出明確的限量。按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2019,小麥中福美雙殘留物以二硫化碳(CS2)表示,最大殘留量為1 mg/kg,折算成福美雙含量約為1.5 mg/kg。目前我國相關(guān)的檢測方法是針對二硫代氨基甲酸酯一類的化合物,無法特異性的實現(xiàn)對福美雙的檢測,因此開展小麥粉中福美雙檢測方法的研究有重要意義。

目前,文獻(xiàn)報道蔬菜、水果、土壤等中福美雙通過轉(zhuǎn)換、提取、凈化等前處理后,采用光譜法[3]、氣相色譜法(GC)[4,5]、高效液相色譜法(HPLC)[6-8]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[1,2,9-13]等方法檢測。二硫代氨基甲酸酯易受pH值、基質(zhì)成分和溫度的影響,在樣品前處理過程中容易降解[2],所以傳統(tǒng)檢測方法將二硫代氨基甲酸酯與酸反應(yīng)生成CS2,通過分光光度法或氣相色譜法(GC)等技術(shù)測定CS2含量,間接計算二硫代氨基甲酸酯的總量[4,14]。但這類方法耗時,靈敏度低,且無法直接得到福美雙的含量。福美雙在堿性緩沖水溶液中,定量轉(zhuǎn)化為DMD陰離子,通過HPLC-UV[6]或LC-MS測定DMD,間接實現(xiàn)福美雙含量的測定[10]。福美鋅在堿性條件下也降解為DMD陰離子,產(chǎn)生假陽性信號,這導(dǎo)致福美雙檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性低[14]。有研究證明,二硫代氨基甲酸酯在亞硫酸鹽存在的情況下,僅福美雙定量轉(zhuǎn)化為DMD-亞硫酸鹽加合物,因此DMD-亞硫酸鹽加合物可作為福美雙檢測的標(biāo)志物[1]。文獻(xiàn)也有通過二氯甲烷、氯仿、己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯或甲醇等有機(jī)溶劑從蔬菜、水果基體中提取福美雙,經(jīng)固相萃取等凈化后,采用HPLC、HPLC-MS/MS直接檢測[15,16]。目前在小麥粉及面粉改良劑中檢測福美雙的文獻(xiàn)較少,以上方法無論從基體適用性還是方法特異性,都不能滿足小麥粉及面粉改良劑中福美雙的定量檢測。

本研究采用乙腈直接溶劑提取,經(jīng)振蕩、超聲等操作后使用液相色譜法檢測小麥粉及面粉改良劑中的福美雙。通過對提取方式、色譜條件及溶液穩(wěn)定性等因素的優(yōu)化和評估,建立了準(zhǔn)確檢測小麥粉及面粉改良劑中福美雙的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD XR液相色譜儀,配有DAD二極管陣列檢測器(日本島津公司); xp205型電子天平(精度為0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司); Vortex-Genie 2型渦旋混合器(美國Scientific Industries公司); KQ 3000 VDV型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); IKA HS 260 Basic型往復(fù)式振蕩搖床(德國IKA公司); Milli-Q型超純水發(fā)生器(美國Millipore公司);娃哈哈純凈水(娃哈哈有限公司);聚丙烯(GHP)有機(jī)濾膜(孔徑0.22 μm)。

乙腈、甲醇、正己烷、丙酮(色譜級,德國Merck公司);二氯甲烷(色譜級,中國克萊曼公司);四氫呋喃(色譜級,美國Sigma-Aldrich公司);福美雙標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號:137-26-8,德國Dr. Ehrenstorfer公司)。小麥粉、面粉改良劑均為市售。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取福美雙標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg),置于100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,充分搖勻,配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃冷藏保存。

分別準(zhǔn)確移取0.15、0.5、1.5、5.0和15 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置于50 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混勻,配制質(zhì)量濃度為0.3、1.0、3.0、10和30 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃冷藏保存。

1.3 樣品前處理

取小麥粉或面粉改良劑代表性樣品約100 g,混勻,裝入潔凈容器中,干燥避光保存。

稱取1 g試樣(精確到0.01 g),置于50 mL具塞塑料離心管中,加入乙腈5 mL,渦旋1 min,振蕩15 min后,冰水浴超聲10 min,靜置2 min(如渾濁,以6 000 r/min高速離心2 min),取上清液,過0.22 μm有機(jī)相濾膜,供測定。

1.4 分析條件

色譜柱:ZORBAX plus-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:25 ℃;流動相:(A)水和(B)乙腈;流速:1.5 mL/min。梯度洗脫程序:0.1～5.0 min, 50%B; 5.0～5.5 min, 50%B～90%B; 5.5～6.5 min, 90%B; 6.5～7.0 min, 90%B ～ 50%B; 7.0～10.0 min, 50%B。流速:1.5 mL/min。進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:280 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶解液的選擇

分別采用異丙醇、甲醇、丙酮、乙腈配制福美雙母液。結(jié)果表明,丙酮的溶解性最佳;乙腈配制后經(jīng)充分振蕩后溶解;異丙醇、甲醇需充分振蕩和超聲后溶解。丙酮色譜吸收截止波長為330 nm,容易對分析物造成干擾,因此采用乙腈制備母液。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1提取溶劑優(yōu)化

福美雙的極性較弱,正辛醇/水分配系數(shù)的對數(shù)(logKow)為1.73,不溶于水,可溶于乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿等有機(jī)試劑。因此,實驗采用1 g樣品,比較了8 mL的正己烷、二氯甲烷、四氫呋喃、丙酮、乙腈、甲醇等溶劑的提取效果(見圖1)。采用正己烷提取時,提取回收率為0;采用四氫呋喃、二氯甲烷和甲醇時,回收率分別為52%～60%、52%～62%和4%～6%;采用丙酮時,回收率為75%～85%,但由于溶劑效應(yīng),福美雙峰形較差;采用乙腈時,提取回收率為86%～94%。Ekroth等[17]采用乙酸乙酯和環(huán)己烷的混合物提取果蔬中福美雙,樣品平均回收率為40%～86%。Dinesh等[7]采用反相高效液相色譜法測定芒果和石榴中福美雙等多種農(nóng)藥,樣品前處理采用乙腈提取和PSA分散固相萃取,平均回收率分別大于87%和96%。江澤軍等[18]采用樣品經(jīng)乙腈提取,PSA、C18吸附劑凈化,水稻植株或稻殼中福美雙的回收率為76%～99%。因此,福美雙的提取效率與基體有較大的相關(guān)性,針對小麥粉及面粉改良劑,選擇乙腈作為提取溶劑。

圖 1 不同提取溶劑對福美雙回收率的影響(n=3)Fig. 1 Effects of different extraction solvents on the recoveries of thiram (n=3)

當(dāng)樣品加標(biāo)水平為15 mg/kg,比較了1 g樣品采用8 mL和5 mL乙腈提取時,福美雙的回收率均為85%～110%,最終選用5 mL乙腈提取,滿足靈敏度且節(jié)約溶劑。同時,比較了1 g樣品5 mL乙腈提取和2 g樣品10 mL乙腈提取,前者的回收率為100.8%, RSD為2.6%,后者回收率為95%, RSD為1.7%,兩者沒有明顯差異。因此,采用1 g樣品5 mL乙腈提取的前處理條件。

2.2.2振蕩、超聲條件優(yōu)化

實驗比較了振蕩與超聲條件的影響。在加標(biāo)水平為7.5 mg/kg和15 mg/kg時,振蕩15 min,福美雙的回收率均為85%～95%,振蕩25 min時,回收率均為89%～100%。冰水浴超聲10 min和15 min的條件,福美雙的回收率均為92%～97%,沒有明顯差異。最終選擇振蕩15 min和冰水浴超聲10 min的前處理條件。

2.3 液相色譜條件優(yōu)化

2.3.1色譜柱的選擇

福美雙分析主要有直接分析法和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的間接分析法。福美雙為弱極性化合物,直接法主要采用C18色譜柱[2,12]分析。間接法是在堿性條件下將福美雙轉(zhuǎn)化為DMD陰離子,采用親水相互作用色譜柱(HILIC柱)檢測[19]。

本實驗比較了HILIC和Amide兩種色譜柱直接檢測福美雙,結(jié)果顯示福美雙沒有保留。另外本方法比較了BEH-C18 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、ZORBAX plus-C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm)和UNITARY C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱的分離情況。結(jié)果顯示,3種色譜柱均能有效保留福美雙。BEH-C18是超高效液相色譜柱,成本偏高,普適性不強(qiáng);采用ZORBAX plus-C18色譜柱時,福美雙的峰形較采用UNITARY C18色譜柱時對稱性好,峰寬窄。因此,最終本研究采用ZORBAX plus-C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱。

2.3.2檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器在200～400 nm掃描范圍內(nèi),得到福美雙的紫外吸收光譜圖(見圖2)。福美雙在220、254和280 nm均有較強(qiáng)吸收,由于220 nm處溶劑干擾較大,因此比較福美雙在254 nm和280 nm的檢測特異性。在254 nm處,加標(biāo)3.0 mg/kg時小麥粉(見圖3a)和面粉改良劑(見圖3b)基質(zhì)干擾大于280 nm,不利于福美雙的定量。因此選用280 nm為檢測波長。

圖 2 福美雙的紫外吸收光譜圖Fig. 2 UV absorption spectrum of thiram

圖 3 加標(biāo)(a)小麥粉和(b)面粉改良劑中福美雙(3.0 mg/kg)的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of thiram (3.0 mg/kg) spiked in (a) wheat flour and (b) flour improvers

2.3.3流動相的選擇

福美雙在堿性條件下生成DMD陰離子,在酸性條件下生成鹽[20],因此本研究不考慮添加酸或者緩沖體系,僅選擇有機(jī)溶劑與水的分離條件。實驗比較了水-甲醇和水-乙腈兩種流動相體系。流動相為水-甲醇體系時,福美雙無法與干擾成分有效分離(見圖4a),因此考察水-乙腈體系。

采用水-乙腈梯度洗脫,雜質(zhì)與福美雙得到有效分離(見圖4b),但是基線逐漸上升。考慮到低濃度檢測的靈敏度,改變流動相梯度,福美雙無干擾且基線穩(wěn)定性得到改善(見圖4c)。因此采用水-乙腈作為最終分離體系。Zhou等[21]采用C18色譜柱,流動相為乙腈-水(50∶50, v/v),能夠完全分離食品樣品中的福美雙與其他物質(zhì)。江澤軍等[18]在水中添加了0.2%甲酸,并比較了甲醇-水和乙腈-水兩種流動相體系,結(jié)果顯示流動相為甲醇-水時,色譜柱壓力較高,且基線噪聲較大。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1福美鋅干擾分析

福美雙和福美鋅結(jié)構(gòu)相似,且紫外光譜類似[1],因此開展了福美鋅干擾實驗研究。比較了在小麥粉樣品中分別添加10 mg/kg福美鋅以及10 mg/kg福美鋅、10 mg/kg福美雙。結(jié)果顯示,僅添加福美鋅時,在福美雙的色譜保留時間內(nèi)沒有色譜峰;同時添加福美鋅和福美雙時,福美雙的回收率為92%～95%,說明福美鋅的存在不干擾福美雙的測定。

2.4.2基質(zhì)效應(yīng)

文獻(xiàn)中土壤和糙米對福美雙具有基質(zhì)抑制,應(yīng)采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液[18],植株、稻殼、豆芽均無明顯基質(zhì)效應(yīng),可用溶劑校準(zhǔn)溶液,采用外標(biāo)法進(jìn)行定量[22]。說明基質(zhì)效應(yīng)與基體密切相關(guān),因此本方法比較了0.3、1.0和3.0 μg/mL由空白小麥粉經(jīng)整個前處理過程得到的基質(zhì)校準(zhǔn)溶液和純乙腈溶液的響應(yīng)差異。結(jié)果顯示,二者的響應(yīng)沒有差異,證明基質(zhì)影響不顯著。因此,直接采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外標(biāo)法定量。

2.4.3線性范圍、檢出限和定量限

在0.30～30 μg/mL線性范圍內(nèi),以福美雙的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/mL)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程為y=38.13x,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 99。

選擇空白樣品,定量添加標(biāo)準(zhǔn)溶液,當(dāng)所得譜圖的信噪比為3和10時,將添加量定義為檢出限和定量限分別為0.5 mg/kg和1.5 mg/kg。果蔬等食品基質(zhì)中福美雙的定量限范圍一般為0.01～2.5 mg/kg[11,17,21-23]。與文獻(xiàn)相比,本研究采用直接檢測,操作簡單,靈敏度滿足標(biāo)準(zhǔn)限量,可用于福美雙的檢測。

圖 4 采用不同流動相和梯度洗脫程序時空白及加標(biāo)樣品的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the blank and spiked samples by different mobile phases and gradient elution programs a. mobile phases: (A) water and (B) methanol; gradient elution program: 0-0.1 min, 40%B, 0.1-6.5 min, 40%B-90%B, 6.5-7.5 min, 90%B, 7.5-8.5 min, 90%B-40%B, 8.5-10 min, 40%B; b. mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution program: 0-0.1 min, 25%B, 0.1-6.5 min, 25%B-80%B, 6.5-7.5 min, 80%B-95%B, 7.5-8.5 min, 95%B-25%B, 8.5-10 min, 25% B; c. mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; 0-5 min, 50%B; 5-5.5 min, 50%B-90%B; 5.5-6.5 min, 90%B; 6.5-7.0 min, 90%B-50%B; 7.0-10 min, 50%B.

2.4.4回收率與精密度

對一種小麥粉和兩種面粉改良劑進(jìn)行添加回收實驗,添加水平分別為1.5、3.0和15 mg/kg。結(jié)果表明,福美雙的平均加標(biāo)回收率為89.6%～98.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～3.9%(n=6),方法精密度良好(見表1)。曹秀等[24]采用甲醇超聲提取,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定小麥粉中福美雙殘留量,加標(biāo)回收率為70.52%～85.20%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.74%～9.42%。結(jié)果顯示,本研究方法有較高的回收率與精密度。

表 1 小麥粉及面粉改良劑中福美雙的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.5 穩(wěn)定性

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液穩(wěn)定性

將福美雙標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0 mg/mL)在4 ℃條件下棕色瓶密封保存,然后分別在1、2、14、21 d取出,稀釋制成0.3、1.0、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,并將其與新制備的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液比較。結(jié)果顯示,儲備液4 ℃放置21 d,福美雙的峰面積與新配制的無顯著性差異。因此,儲備液4 ℃放置21 d穩(wěn)定性良好。

2.5.2系列標(biāo)準(zhǔn)溶液

將配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.3、1.0、3.0、10.0和30.0 μg/mL)在4 ℃條件下棕色瓶密封保存,在一定時間后(2 d和14 d)取出測定。結(jié)果顯示,0、2、14 d的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積基本一致。因此,系列校準(zhǔn)溶液在4 ℃冷藏避光下至少可以穩(wěn)定保存14 d。

2.5.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的短期穩(wěn)定性

取3 μg/mL福美雙標(biāo)準(zhǔn)溶液置于棕色瓶中,分別考察室溫光照4 h和室溫避光48 h內(nèi)福美雙峰面積變化情況。福美雙響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%和0.7%?？梢姼Ｃ离p在乙腈溶液中較為穩(wěn)定。

2.5.4提取溶液的穩(wěn)定性

在一種小麥粉樣品、3種小麥粉改良劑樣品中分別添加10 mg/kg福美雙,將處理好的樣品在5、12、24、36 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣,福美雙在小麥粉和兩種小麥粉改良劑中的響應(yīng)變化均小于10.0%,而在一種小麥粉改良劑中的福美雙響應(yīng)下降50%。因此需要考慮提取液的穩(wěn)定性,建議處理完12 h內(nèi)上機(jī)測定。

3 結(jié)論

本文采用乙腈提取,HPLC-DAD直接測定小麥粉及面粉改良劑中福美雙的方法。該方法操作簡單,精密度高,靈敏度好,設(shè)備成本低,適用于實際大量檢測使用。