盛騫瑩, 周 揚(yáng), 趙治全, 王耀慧, 李偉誠(chéng), 柯燕雄, 藍(lán)閩波*, 卿光焱, 梁鑫淼,3

(1. 華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 上海 200237; 2. 華東理工大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200237; 3. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023)

繼基因組學(xué)之后,蛋白質(zhì)組學(xué)成為新的研究熱點(diǎn)。作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者,蛋白質(zhì)的多種翻譯后修飾(糖基化、磷酸化、甲基化、泛素化修飾等)參與或者調(diào)控生物體內(nèi)重要的生理、病理過程,并在人體不同的健康狀況或生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)生改變[8-10]。其中,蛋白質(zhì)的糖基化修飾是上述幾種修飾蛋白質(zhì)中最常見、最重要的翻譯后修飾之一[11,12]。糖蛋白組學(xué)研究有幾個(gè)任務(wù),分別為發(fā)生糖基化的蛋白質(zhì)的鑒定、糖肽結(jié)構(gòu)的解析、糖基化位點(diǎn)的鑒定和研究糖基化對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響[13-16]。生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使人們能在分子水平上進(jìn)行糖蛋白或糖肽的有效監(jiān)測(cè)[17,18]。但是,和其他蛋白質(zhì)相比,糖蛋白的數(shù)量較低,酶解后的糖肽豐度就更低了,因此,需要一些手段對(duì)糖肽進(jìn)行有效的富集,以提高其檢測(cè)豐度[19-22]。開發(fā)新的富集方法和富集材料是糖蛋白組學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[23-30]。

COFs有序堅(jiān)固的框架孔道結(jié)構(gòu),提供了作為糖肽富集材料載體的條件,同時(shí)基于載體骨架結(jié)構(gòu)的功能化修飾也將大大提升糖肽富集分離效率[31-34]。Zhang課題組[35]將一種新型COF功能化的磁性石墨烯復(fù)合物(MagG@COF-5)作為超敏感基質(zhì)用于識(shí)別糖肽,通過LC-MS/MS分析,成功地檢測(cè)到了232個(gè)獨(dú)特的N-連接糖肽和85個(gè)特征糖蛋白。N-連接糖肽已被證明是治療各種疾病的關(guān)鍵生物標(biāo)志物,Zhang課題組[36]研究出的還原型谷胱甘肽功能化銀納米粒子修飾COFs材料應(yīng)用于N-連接糖肽的富集研究中,提高了COFs的富集選擇性,并提供了一種新的方法。Wu課題組[37]使用磁性膠體納米晶體簇(MCNC)作為核心,利用后修飾策略制備了另一種谷胱甘肽功能化的高親水性磁性COFs,用于人唾液中內(nèi)源性N-連接糖肽的富集,同樣表現(xiàn)出優(yōu)異的糖肽富集性能,如高靈敏度及選擇性、良好的尺寸排阻效應(yīng)和可重復(fù)使用性等。但目前將結(jié)構(gòu)修飾功能化的COFs材料應(yīng)用于糖蛋白組學(xué)的研究還在起步階段,相關(guān)研究較少,也存在糖肽選擇性不足、相互特異性作用不強(qiáng)等問題。

本文以開發(fā)新的糖肽富集材料為目的,結(jié)合COFs材料的功能化修飾,以2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛(DMTA)和1,3,5-三(4-氨苯基)苯(TAPB)為單體,通過溶劑熱法,首先制備得T-D-COF,再用亞氯酸鈉溶液進(jìn)行氧化,發(fā)展出一種新的材料O-T-D-COF。將該材料進(jìn)行糖肽的富集應(yīng)用,在復(fù)雜體系驗(yàn)證富集選擇性,以及考察富集檢測(cè)限、富集容量和回收率?；贑OFs功能化修飾的新材料,有望為開發(fā)糖肽富集新材料提供新的思路,為糖蛋白組學(xué)提供了一種選擇性更優(yōu)、可控性更好的糖肽富集新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TAPB、DMTA、正丁醇、鄰二氯苯、冰醋酸、碳酸氫銨、尿素購(gòu)自麥克林生化科技有限公司(中國(guó)上海)。甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國(guó)上海)。四氫呋喃、硼氫化鈉、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(中國(guó)上海)。人血清免疫球蛋白G(IgG)、牛血清白蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶、N-糖苷酶F(包含Glycobuffer)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó))。此外,實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水。人血清樣本采集自健康人,按照標(biāo)準(zhǔn)臨床程序從上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院獲得。

掃描電子顯微鏡(SEM)的型號(hào)為S-3400N (Hitachi,日本),透射電子顯微鏡(TEM)的型號(hào)為JEOL JEM-1400(JEOL,日本),固體核磁測(cè)試采用500MHz核磁共振波譜儀(Bruker,瑞士),紅外光譜采用全反射傅立葉紅外光譜儀(ATR-FTIR)型號(hào)為Nicolet 6700 (Thermo Scientific,美國(guó))。

1.2 COFs的制備

稱取TAPB 0.526 g(1.5 mmol),裝于50 mL三口燒瓶中;量取10 mL鄰二氯苯和10 mL正丁醇,混合均勻后加入到三口燒瓶中,將燒瓶放在攪拌器上充分?jǐn)嚢琛＝又?稱取0.436 g(2.25 mmol)DMTA,倒入三口燒瓶中,用移液槍吸取2 mL(6 mol)冰醋酸,裝入三口燒瓶中作為催化劑。用橡皮塞把三口燒瓶的兩端塞緊,中間放上冷凝管,冷凝管的上方接上油封裝置,將針頭插入橡皮塞后插到液面以下,通入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù),調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁繛槊棵胍粋€(gè)氣泡。將三口燒瓶放入油浴鍋中,120 ℃冷凝回流,磁力攪拌。72 h后停止攪拌和加熱,待裝置冷卻到室溫后,抽濾得到黃色的固體產(chǎn)物。產(chǎn)物用四氫呋喃重復(fù)洗滌7次,去除雜質(zhì)。洗滌后的產(chǎn)物放入30 ℃干燥箱隔夜烘干,得到黃色粉末,標(biāo)記為T-D-COF。稱取47.08 mg T-D-COF粉末,溶于4 mL二惡烷中制成懸浮液。向懸浮液中依次加入2.548 mL(24.0 mmol)2-甲基-2-丁烯、400 μL濃度為3.3 mol/L的亞氯酸鈉水溶液、137.6 μL(2.4 mmol)冰醋酸。所用的T-D-COF、2-甲基-2-丁烯、亞氯酸鈉和冰醋酸的物質(zhì)的量之比為1∶100∶5.5∶10。在室溫避光的條件下,將兩相懸浮液持續(xù)攪拌20 h,所得產(chǎn)物為紫黑色固體。反應(yīng)后的體系通過過濾分離,得到的固體依次用40 mL超純水、40 mL 10%(體積分?jǐn)?shù))硫代硫酸鈉、40 mL超純水和40 mL丙酮洗滌,產(chǎn)物置于60 ℃真空干燥箱中干燥10 h,得到紫色粉末,標(biāo)記為O-T-D-COF,制備過程如圖1所示。

圖 1 O-T-D-COF的合成路線Fig. 1 Synthetic route of O-T-D-COF

1.3 蛋白酶解

稱取1 mg IgG (或1 mg BSA),用100 μL含有8 mol尿素的50 mmol碳酸氫銨的溶液將IgG完全溶解,向溶液中加入5 μL DTT(200 mmol),在恒溫56 ℃的條件下振蕩45 min。取20 μL IAA(200 mmol)避光條件下配制,加入到振蕩后的溶液中,避光條件下靜置30 min。然后向溶液中繼續(xù)加入碳酸氫銨溶液,直至溶液體積達(dá)到1 mL。向溶液中加入20 μg胰蛋白酶后,將溶液放置在37 ℃的培養(yǎng)器中,持續(xù)酶解17 h后向體系中加入5 μL甲酸(FA)使酶解反應(yīng)停止。

《Java程序設(shè)計(jì)》課程在泛雅平臺(tái)上的應(yīng)用，是一種新型的教學(xué)模式，仍然存在些許缺陷，但如今各高校都開始重視這種富媒體與教學(xué)結(jié)合的模式，開始進(jìn)行不斷的探索，在具體應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)問題，解決問題：

1.4 糖肽的富集

使用離心法進(jìn)行O-T-D-COF材料對(duì)糖肽的富集實(shí)驗(yàn),在離心管中加入500 μg O-T-D-CO材料,加入100 μL上樣液(ACN∶H2O∶TFA=90∶5∶5, v/v/v),超聲1 min、振蕩5 min進(jìn)行潤(rùn)洗,離心去除上清液;取IgG樣品(之前已分裝旋干)6 μL,用180 μL上樣液重溶;20 μL上樣液溶解O-T-D-COF材料,將溶解了O-T-D-COF材料的上樣液轉(zhuǎn)移至IgG的溶液中,超聲1 min、振蕩30 min進(jìn)行孵化,離心去除上清液;將上樣后的材料分散在200 μL的淋洗液(ACN∶H2O∶TFA=90∶9.9∶0.1, v/v/v)中,超聲1 min、振蕩5 min進(jìn)行淋洗,離心去除上清液,重復(fù)該步驟3次;取10 μL洗脫液(H2O∶TFA=99∶1, v/v)加入離心管中,超聲1 min、振蕩20 min將富集在材料中的糖肽分離出來,離心后保留上清液。復(fù)雜體系中的富集、富集檢測(cè)限、富集容量和回收率操作參照以上操作流程。

1.5 脫糖基實(shí)驗(yàn)

人血清蛋白酶解液的富集按照1.4節(jié)進(jìn)行操作,將糖肽樣品凍干后加入17 μL水和2 μL Glycobuffer,混勻,再加入1 μLN-糖苷酶F(PNGase F)。37 ℃下振蕩17 h后,離心濃縮,重溶于10 μL含0.1%(v/v)的FA溶液中,等待進(jìn)一步進(jìn)行分析。

1.6 分析條件

糖肽樣品洗脫液的檢測(cè)使用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(簡(jiǎn)稱MALDI-TOF/TOF-MS, AB Sciex,美國(guó)),在反射正離子模式下進(jìn)行分析。取1 μL富集后的洗脫液,點(diǎn)在靶上,待溶液自然干燥后,取1 μL質(zhì)量濃度為25 mg/mL的DHB基質(zhì)溶液(ACN∶H2O∶H3PO4=70∶29∶1, v/v/v)覆蓋在樣品點(diǎn)上。質(zhì)譜儀的檢測(cè)范圍是m/z2 000～3 500,激光強(qiáng)度是3 800 μJ。得到的結(jié)果利用軟件Data Explorer (TM) Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,獲得質(zhì)譜圖峰的信息,其中峰的分辨率設(shè)置為0.95,S/N>3。

人血清提取蛋白酶解液的糖基化肽段/蛋白質(zhì)采用賽默飛高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Thermo EASY-nanoLC 1000 Nano HPLC System (Thermo Fisher Scientific,德國(guó))分析,該儀器配備了納升液相色譜和Q-Exactive plus質(zhì)譜儀。采用同公司納米反相C18柱(15 cm×75 μm)。流動(dòng)相A為ACN-FA(99.9∶0.1, v/v), B為H2O-FA (99.9∶0.1, v/v)。洗脫方式如下:0%B～4%B, 2 min; 4%B～35% B, 90 min; 35%B～45% B, 10 min; 45%B～90%B, 5 min; 90% B, 5 min;最后用100%A沖洗柱子15 min。流動(dòng)相流速為300 nL/min,柱溫為25 ℃,進(jìn)樣量為1 μL。Q-Exactive plus質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為:電噴霧電壓為2.0 kV,掃描范圍為m/z400～2 000; MS/MS采集在Orbitrap中進(jìn)行,分辨率為35 000(m/z200)。數(shù)據(jù)處理:采用搜索軟件Protein Discovery 1.4對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫(kù),搜索引擎為Sequest HT,該搜索引擎可搜索所有數(shù)據(jù)庫(kù)包括人的UniProtKB/SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 O-T-D-COF材料的合成

本實(shí)驗(yàn)用到的合成方法是溶劑熱法。本實(shí)驗(yàn)合成的O-T-D-COF材料是一種具有二維(2D)結(jié)構(gòu)的材料,反應(yīng)單體分別是TAPB和DMTA。這兩種單體中分別含有醛基和氨基,通過共聚縮合反應(yīng)生成的席夫堿構(gòu)成了T-D-COF材料的框架,每6份單體組合成一個(gè)六邊形的大環(huán),這些大環(huán)再通過層層堆疊形成2D的管狀結(jié)構(gòu)。該反應(yīng)對(duì)原料和產(chǎn)物的溶解性要求較高。在溶劑中,原料慢慢溶解到溶劑中參與反應(yīng),這樣有利于合成的材料具有有序的結(jié)構(gòu),并且能夠最大限度地減少材料結(jié)構(gòu)上的缺陷。因此本實(shí)驗(yàn)選擇的溶劑是正丁醇和鄰二氯苯,這二種溶劑對(duì)上述兩種單體的溶解性都比較小,有利于原料緩慢溶解到溶劑中。冰醋酸作為反應(yīng)的催化劑可以活化反應(yīng)物中的羰基,有利于脫水縮合反應(yīng)。然后對(duì)合成后的COFs材料進(jìn)行氧化處理,可以提高材料的富集性能。2D層狀的O-T-D-COF材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來自于層與層的作用力,夾層間的作用力是形成堆積結(jié)構(gòu)的重要作用力,直接影響到材料的孔隙率和結(jié)晶性。在材料中引入的甲氧基就很好地加強(qiáng)了層與層之間的作用力,甲氧基處于苯基的邊緣上,每個(gè)氧原子上的二對(duì)孤電子對(duì)轉(zhuǎn)移到苯環(huán)中心,這就使得層與層之間電荷排斥力減小,從而增強(qiáng)了夾層間的作用力,改善了O-T-D-COF材料的穩(wěn)定性和結(jié)晶性。

圖 2 O-T-D-COF材料放大(a)5 000倍和(b)18 000倍的SEM圖及(c)固體核磁13C譜和(d)紅外光譜圖Fig. 2 SEM images of O-T-D-COF at (a) 5 000 and (b) 18 000 magnifications, and (c)13C NMR spectra and (d) IR spectra of O-T-D-COF

2.2 O-T-D-COF材料的表征

通過掃描電鏡觀察O-T-D-COF材料的形貌,圖2a和2b是材料O-T-D-COF在掃描電鏡下成像的圖片,從圖中可以看到O-T-D-COF材料呈略規(guī)則狀聚集在一起。放大倍數(shù)為5 k倍時(shí),從圖2a可以看出O-T-D-COF材料的空間分布很密集,單個(gè)單元尺寸較小。放大倍數(shù)為18 k倍時(shí)(見圖2b)可以看到每個(gè)單元之間結(jié)合比較緊密,結(jié)構(gòu)較為規(guī)則。圖2c是O-T-D-COF材料的固體核磁表征圖,從圖中的1號(hào)峰位置可以看出材料被部分氧化。紅外光譜進(jìn)一步表征T-D-COF與O-T-D-COF材料的特征峰差異(見圖2d)。在材料氧化后,譜圖上1 668 cm-1附近的峰是酰胺鍵的C=O伸縮振動(dòng),1 515 cm-1出現(xiàn)新的伸縮振動(dòng)峰,該峰為酰胺基帶的峰,這一結(jié)果也說明了COFs材料已被成功制備。

通過透射電鏡觀測(cè)物質(zhì)微觀形貌時(shí),能夠看到其聚集狀態(tài),分辨率高時(shí)還能看到晶體的晶格條紋,從而可以測(cè)量材料的孔徑大小。圖3為O-T-D-COF材料在透射電鏡中形成的圖像,從圖中可以看到,材料中單元的規(guī)則結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)密集狀態(tài),在高倍分辨率下能看到晶體的晶格條紋明暗對(duì)比,單元呈中空狀態(tài),表明該材料具有規(guī)則的孔道結(jié)構(gòu)。

圖 3 O-T-D-COF材料的TEM圖Fig. 3 TEM images of O-T-D-COF

2.3 O-T-D-COF材料的糖肽富集條件優(yōu)化

IgG是人體免疫系統(tǒng)中的一種保護(hù)物質(zhì),對(duì)IgG的研究在疾病診斷等領(lǐng)域有重要意義。IgG主要分為IgG 1和IgG 2兩個(gè)亞型,都具有糖基化的位點(diǎn),且位點(diǎn)上均連接了一個(gè)以五碳作為核心的聚糖。本文利用MALDI技術(shù)測(cè)定富集洗脫液中的糖肽,通過譜圖分析探討富集效果。

在上樣液酸度條件的優(yōu)化中,使用了4種不同酸度的上樣液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中TFA的體積分?jǐn)?shù)分別是:0.1%、1%、3%、5%,配制成乙腈體積分?jǐn)?shù)為90%的酸性溶液。如圖4a所示,當(dāng)上樣液中TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.1%、1%和3%時(shí),6條糖肽的信號(hào)峰都較弱;相比之下,在TFA體積分?jǐn)?shù)在5%時(shí),每一個(gè)柱形都明顯比前3組對(duì)應(yīng)柱形的長(zhǎng)度更長(zhǎng),說明此酸濃度下的上樣條件更有利于富集,因此得出上樣液中TFA的最佳體積分?jǐn)?shù)為5%。

圖 4 (a)上樣液的酸度、(b)上樣液中的乙腈體積分?jǐn)?shù)、(c)淋洗液的酸度、(d)洗脫液的酸度對(duì)富集效果的影響Fig. 4 Effects of (a) loading buffer acidity, (b) ACN volume percentage in loading buffer, (c) washing buffer acidity, and (d) eluent buffer acidity on enrichmentm/z 2601.2, 2633.2, 2764.1, 2795.5, 2925.6, and 2957.5: six highly abundant glycopeptides of IgG digests.

考察上樣液中的乙腈的體積分?jǐn)?shù),分別設(shè)為85%、88%、90%、95%, TFA的體積分?jǐn)?shù)固定為5%。如圖4b所示,隨著上樣液中乙腈濃度的增加,信號(hào)強(qiáng)度先增加后減少。當(dāng)乙腈達(dá)到90%時(shí),6條肽的信號(hào)均比其他3組的結(jié)果好,說明此時(shí)富集效果最好。這一結(jié)果可以說明,乙腈低于90%時(shí),糖肽不能很好地與O-T-D-COF材料結(jié)合,而乙腈高于90%時(shí),糖肽在上樣液中的溶解性較差,從而降低了富集效果。因此得出結(jié)論,上樣液中最佳的乙腈體積分?jǐn)?shù)為90%。

為了更好地淋洗與分離材料上的非糖肽物質(zhì)和其他雜質(zhì),進(jìn)一步優(yōu)化了淋洗液?？疾觳煌岫鹊牧芟匆簩?duì)富集效果的影響,分別配制了TFA體積分?jǐn)?shù)為0.1%、1%、3%和5%的淋洗液,淋洗液中ACN的體積分?jǐn)?shù)固定為90%。從圖4c可以看出,淋洗液中TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí),糖肽的信號(hào)最好,隨著淋洗液酸度的增加,糖肽信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低。這一結(jié)果說明,淋洗液的酸度變高可能會(huì)造成糖肽的流失,不利于材料對(duì)糖肽的富集。

最后,為了考察洗脫液中酸濃度對(duì)富集效果的影響,分別配制了4種洗脫液條件,其中TFA的體積分?jǐn)?shù)分別為7%、5%、3%、1%。從圖4d可以看出,只有第4組的6條信號(hào)峰信號(hào)較強(qiáng),此時(shí)洗脫液中酸的體系分?jǐn)?shù)為1%。因此得出結(jié)論,洗脫液中TFA的最佳體積分?jǐn)?shù)為1%。

圖 5 富集(a)前和(b)最優(yōu)條件下富集的糖肽質(zhì)譜圖Fig. 5 Mass spectra of the tryptic digest of IgG (a) before and (b) after enrichment under optimum conditions m/z of glycopeptide peak No. 1: 2398.5; 2: 2430.4; 3: 2455.5; 4: 2487.5; 5: 2560.5; 6: 2592.5; 7: 2601.2; 8: 2617.5; 9: 2633.2; 10: 2642.4; 11: 2649.5; 12: 2659.0; 13: 2691.0; 14: 2764.1; 15: 2779.6; 16: 2795.5; 17: 2804.5; 18: 2811.5; 19: 2821.3; 20: 2836.5; 21: 2853.3; 22: 2925.6; 23: 2957.5; 24: 2966.6; 25: 2983.2; 26: 2998.5; 27: 3015.1; 28: 3054.5; 29: 3129.2; 30: 3160.5; 31: 3216.6; 32: 3248.6.

以上的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明,O-T-D-COF材料對(duì)糖肽的保留是結(jié)合親水作用和靜電作用的結(jié)果。O-T-D-COF對(duì)糖肽有較強(qiáng)的親水作用,對(duì)糖肽有很強(qiáng)的保留。通過親水模式的洗脫富集,以及淋洗操作條件優(yōu)化,可以很好地去除非糖肽。圖5是未經(jīng)過材料富集的糖肽酶解液的質(zhì)譜圖和經(jīng)材料在最優(yōu)條件下富集的IgG糖肽樣品的質(zhì)譜圖的對(duì)比。圖5a中,由于糖肽酶解液中存在高豐度的非糖肽及雜質(zhì)信號(hào),這些物質(zhì)在質(zhì)譜檢測(cè)中會(huì)嚴(yán)重干擾和抑制糖肽的信號(hào),使得質(zhì)譜儀不容易檢測(cè)到糖肽的信號(hào),未經(jīng)材料富集的糖肽的信號(hào)峰只有4條,豐度低且選擇性差。而圖5b中,一共可以鑒定到32條糖肽的信號(hào)峰,并且?guī)缀鯖]有非糖肽信號(hào)的干擾,很好地提高了糖肽富集選擇性與檢測(cè)豐度。

2.4 O-T-D-COF材料的富集選擇性驗(yàn)證

為考察O-T-D-COF材料在復(fù)雜體系中對(duì)富集糖肽的選擇性,將IgG和BSA的酶解液混合,以此為研究對(duì)象,考察O-T-D-COF材料在復(fù)雜體系中的糖肽富集情況。圖6a為IgG和BSA酶解液物質(zhì)的量之比為1∶10的糖肽富集結(jié)果,可以鑒定到30條糖肽的信號(hào)峰,并且信號(hào)豐度佳。圖6b為IgG和BSA酶解液物質(zhì)的量之比為1∶50的糖肽富集結(jié)果,可以鑒定到24條糖肽信號(hào)峰,依然保持了較好的富集豐度及富集選擇性。以上結(jié)果都展示出O-T-D-COF材料在糖肽富集領(lǐng)域較好的應(yīng)用潛力。

圖 6 復(fù)雜體系的糖肽富集質(zhì)譜圖Fig. 6 Mass spectra of the complex system for glycopeptides enrichment Mixture of tryptic digests of human serum immunoglobulin G (IgG) and bovine serum albumin (BSA) at amount of material ratios of (a) 1∶10 and (b) 1∶50. Peak Nos.: see Fig. 5.

圖 7 (a)5 fmol/μL和(b)2.5 fmol/μL的IgG酶解液的富集質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectra of the tryptic digests of (a) 5 fmol/μL and (b) 2.5 fmol/μL IgGPeak Nos.: see Fig. 5.

2.5 O-T-D-COF材料的富集檢測(cè)限

在糖肽富集實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)限是指在滿足實(shí)驗(yàn)要求的情況下,待測(cè)糖肽樣品的最小濃度。O-T-D-COF材料檢測(cè)限的大小代表了材料在低豐度糖肽樣品中,對(duì)糖肽的特異性吸附能力大小。因此,在富集檢測(cè)限的研究中,分別配制了5 fmol/μL和2.5 fmol/μL的低濃度IgG酶解液溶液進(jìn)行富集操作。圖7a為5 fmol/μL樣品的富集結(jié)果,可以鑒定到16條糖肽的信號(hào)峰,其中6條高豐度糖肽的信號(hào)較強(qiáng)。圖7b圖為2.5 fmol/μL樣品的富集結(jié)果,仍能鑒定到12條糖肽信號(hào)峰,且6條高豐度糖肽的信號(hào)較強(qiáng)。從這一結(jié)果可以得出,當(dāng)樣品的濃度低至2.5 fmol/μL時(shí),依然可以進(jìn)行糖肽信號(hào)的有效鑒定,說明O-T-D-COF材料在低濃度的糖肽樣品中仍然對(duì)糖肽有較好的特異性識(shí)別能力。

2.6 O-T-D-COF材料的富集容量

O-T-D-COF材料的富集容量是一項(xiàng)重要的考察指標(biāo),實(shí)驗(yàn)中固定糖肽樣品的質(zhì)量為6 μg,以不同質(zhì)量(10、20、30、40、50、100、150和200 μg)的材料進(jìn)行富集。圖8為不同材料用量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,縱坐標(biāo)為質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)弱。從圖8中可以看出,隨著材料量的增加,質(zhì)譜信號(hào)逐漸增加;當(dāng)材料質(zhì)量增至50 μg時(shí)6條信號(hào)峰的強(qiáng)度最強(qiáng);此后,信號(hào)強(qiáng)度趨于平緩。因此,得出O-T-D-COF材料對(duì)糖肽的富集容量為120 mg/g。

圖 8 不同質(zhì)量O-T-D-COF材料富集6 μg IgG酶解液的結(jié)果Fig. 8 Results of enrichment of 6 μg IgG tryptic digest with different amount of O-T-D-COF materials m/z 2601.2, 2633.2, 2764.1, 2795.5, 2925.6, and 2957.5: glycopeptides.

圖 9 從IgG酶解液回收輕/重二甲基標(biāo)記的去糖基化肽的3組平行試驗(yàn)Fig. 9 Three paralleled experiments of the recovery of the light- and heavy-dimethyl labeled deglycosylated peptides from human IgG tryptic digest

2.7 O-T-D-COF材料的富集回收率

通過穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記的方法進(jìn)行了O-T-D-COF材料富集回收率的考察。該實(shí)驗(yàn)需要通過兩步進(jìn)行,第一次富集的樣品是3 μg氘代二甲基標(biāo)記的IgG酶解液,將第一次實(shí)驗(yàn)所得洗脫液凍干,與3 μg二甲基標(biāo)記的IgG酶解液混合得到第二次待富集樣品。經(jīng)第二次富集所得的洗脫液經(jīng)過凍干,脫糖基后用于MALDI分析,本實(shí)驗(yàn)平行做3組進(jìn)行對(duì)比。IgG的兩條糖肽序列分別為EEQYN#STYR和EEQFN#STFR(N#為修飾位點(diǎn))。經(jīng)過脫糖基后的兩條糖肽的m/z分別是1 158.5和1 190.5,由二甲基標(biāo)記過的兩條糖肽的m/z分別是1 186.6和1 218.5(標(biāo)記為輕樣)；用氘代二甲基標(biāo)記后兩條脫糖基肽段的m/z分別增加至1 190.6和1 222.5(標(biāo)記為重樣)。如圖9所示,輕樣和重樣的信號(hào)峰同時(shí)出現(xiàn)在譜圖中,同一條糖肽的輕樣和重樣信號(hào)峰的信號(hào)強(qiáng)度之比即為O-T-D-COF材料的回收率。

將3組平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果統(tǒng)計(jì)到表1中,再計(jì)算其平均值分別為103.5%和101.5%,該值即為O-T-D-COF材料的回收率。

表 1 人IgG酶解液經(jīng)O-T-D-COF材料富集后兩個(gè)去糖基化肽的回收率(n=3)

2.8 O-T-D-COF材料在實(shí)際樣品中的應(yīng)用

從前期的結(jié)果可知,該材料擁有良好的富集性能,因此被進(jìn)一步應(yīng)用于人血清樣品的糖肽富集。人血清樣品是目前糖肽富集中研究最多的生物樣品,包含了豐富的生理和病理狀況信息。但血清中,糖蛋白的分析因其豐度低具有較大的難度,需要用有效的樣品富集前處理操作,才能將其檢測(cè)到。我們利用高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)O-T-D-COF材料富集結(jié)果進(jìn)行了檢測(cè)與分析,得到了血清中來自53個(gè)N-糖蛋白中的86個(gè)N-糖肽序列,并鑒定到了94個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com/)。

3 結(jié)論

本文利用溶劑熱合成法制備了一種2D層狀、具有孔洞結(jié)構(gòu)的O-T-D-COF材料,結(jié)合SEM和TEM對(duì)其進(jìn)行了表征。將制備的材料進(jìn)行了氧化后處理以提高材料對(duì)糖肽富集的效率,且成功應(yīng)用于糖肽的選擇性富集。建立了一個(gè)較為完整的體系,探討了富集過程中上樣液條件、淋洗液條件、洗脫液條件等對(duì)富集結(jié)果的影響,對(duì)富集條件進(jìn)行了優(yōu)化。并在復(fù)雜樣品體系進(jìn)行了富集選擇性的驗(yàn)證,表明O-T-D-COF材料在IgG和BSA酶解液的物質(zhì)的量之比為1∶50時(shí),具有良好的糖肽富集選擇性。同時(shí)。具有較低的檢測(cè)限(2.5 fmol/μL)、較高的富集容量(120 mg/g),及較好的富集回收率(103.5%、101.5%)。最后,我們將O-T-D-COF應(yīng)用于實(shí)際樣品中的糖肽富集,得到了血清中來自53個(gè)N-糖蛋白中的86個(gè)N-糖肽序列,并鑒定到了94個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。這些都展現(xiàn)了O-T-D-COF材料在糖肽富集領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。