李 雪, 晏志鳳, 李龍珠, 馬 濤*, 陳 陽,*

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 安徽 蚌埠 233030; 2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院公共基礎(chǔ)學(xué)院, 安徽 蚌埠 233030)

人參為五加科植物人參(Panax ginseng C. A. Mey.)的干燥根和根莖,是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,最早出現(xiàn)在《神農(nóng)本草經(jīng)》中,具有大補元氣、固脫、生津、安神和益智等功效[1]。人參的化學(xué)成分較為復(fù)雜,研究已表明,人參皂苷為人參中的主要活性成分[2],具有抗腫瘤[3-6]、調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)[7]、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8,9]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[10]、抗疲勞[11]、抗氧化[12]、抗輻射[13]、抗衰老[14]和抗糖尿病[15]等多種藥理作用,但其在人參中含量較低,測定時易受到其他組分的干擾。因此,采用合適的人參皂苷富集方法對人參皂苷分析具有十分重要的意義。

硼親和材料是一種選擇性分離富集順式二羥基生物分子的功能性材料[16],硼酸配體可以可逆地與含順式二羥基的化合物結(jié)合,如糖蛋白[17]、聚糖、糖類、核苷和核苷酸。這些含順式二羥基的生物分子在蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、糖組學(xué)、糖生物學(xué)等當前科學(xué)前沿中是重要的目標分子[18]。但單一硼酸對含有順式二羥基化合物的結(jié)合強度相對較弱,因此,用傳統(tǒng)的硼酸鹽親和材料無法勝任低濃度的順式二羥基分子的選擇性富集任務(wù)[19]。支鏈聚乙烯亞胺(PEI)可以作為一種較好的載體來擴增材料表面可供修飾的官能團,使硼酸位點大量增加[20]。人參皂苷分子多數(shù)都具有多糖鏈結(jié)構(gòu),這也為多位點協(xié)同結(jié)合提供了基礎(chǔ)(具體結(jié)合原理見圖1)。Li等[21]制備了PEI修飾硼親和毛細管整體柱,結(jié)果表明其對于糖蛋白的結(jié)合力較單一硼酸提高了1～2個數(shù)量級。同時,納米顆粒在分離、催化、傳感器和藥物傳遞等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。其中磁性Fe3O4納米顆粒由于其良好的生物相容性、超順磁性、低毒性和易于操作等特性在樣品制備中得到廣泛關(guān)注[22-25]。最近,本課題組制備了硼酸修飾的介孔硅納米顆粒,并成功用于人參皂苷的選擇性富集[26]。但由于單一硼酸與人參皂苷分子較低的結(jié)合力,此方法尚不能滿足中成藥中人參皂苷的分析需求,因此需要選用與人參皂苷分子具有更高親和力的功能化材料。

圖 1 支鏈聚乙烯亞胺修飾的硼親和磁性納米粒子(PEI-BA-MNPs)與人參皂苷Re結(jié)合示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the combination of polyethyleneimine-functionalized boronate affinity magnetic nanoparticles (PEI-BA-MNPs) and ginsenoside Re

本研究中,以Fe3O4納米顆粒為磁核,采用支鏈聚乙烯亞胺作為支架放大后修飾的硼酸(3-甲?；脚鹚?官能團數(shù)目,合成了一種支鏈聚乙烯亞胺修飾的硼親和磁性納米粒子(PEI-BA-MNPs),采用磁性固相萃取的方法實現(xiàn)了人參皂苷的高效富集。以人參皂苷Re為例,對于材料性能進行驗證,同時結(jié)合高效液相色譜定量分析,測定實際樣品啟脾口服液中的人參皂苷含量。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

透射電子顯微鏡(TEM)JEM1010系統(tǒng)(日本東京JEOL);超微量紫外可見分光光度計(美國Thermo Fisher公司); HPLC系統(tǒng)為Waters公司,該系統(tǒng)由1525二元溶劑泵、2998 PDA檢測器和2707自動進樣器組成。

PEI(相對分子質(zhì)量10 000)購自阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司,六水合三氯化鐵、乙二醇、無水乙酸鈉、1,6-己二胺、5%(v/v)戊二醛甲醇溶液、無水甲醇、乙腈、磷酸、正丁醇、三氯甲烷、氰基硼氫化鈉、3-甲?；脚鹚?、乙酸、磷酸鈉(十二水)、氨試液、腺苷、脫氧腺苷、葡萄糖、果糖均為分析純,購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。實驗用水均為Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水。人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、原人參三醇、原人參二醇購自上海源葉生物科技有限公司,均為分析標準品,純度≥98%。

啟脾口服液(吉林益民堂制藥有限公司)購自當?shù)厮幍?蚌埠)。

1.2 磁性納米粒子的制備

1.2.1Fe3O4磁性納米粒子的制備

首先將FeCl3·6H2O(2.0 g)溶解在60 mL的乙二醇中,形成澄清的橙黃色溶液。然后,向上述溶液中添加4.0 g無水乙酸鈉和13.0 g 1,6-己二胺。將混合物劇烈攪拌30 min,并密封在100 mL反應(yīng)釜中,在198 ℃下反應(yīng)6 h,得到氨基修飾的Fe3O4磁性納米粒子(AMNPs)。

1.2.2支鏈聚乙烯亞胺修飾的磁性納米粒子(PEI -MNPs)的制備

將200 mg AMNPs加入40 mL 5%(v/v)戊二醛甲醇溶液中,在室溫下機械攪拌12 h。所得戊二醛活化的MNPs用無水甲醇洗滌4次后,先加入20 mL無水甲醇,然后用超聲波分散在含有0.5 g PEI的20 mL無水甲醇中。在室溫下將混合物機械攪拌12 h。隨后每6 h加入10 mL氰基硼氫化鈉甲醇溶液(20 g/L),持續(xù)反應(yīng)12 h。用磁鐵收集反應(yīng)得到的PEI-MNPs,洗滌后進行真空干燥。將獲得的PEI-MNPs儲存以備進一步使用。

1.2.3PEI-BA-MNPs和硼親和磁性納米粒子(BA-MNPs)的制備

首先將200 mg PEI-MNPs用超聲分散在30 mL無水甲醇中,隨后加入10 mL 3-甲酰基苯硼酸無水甲醇溶液(50 g/L)中,再加入10 mL氰基硼氫化鈉甲醇溶液(30 g/L),攪拌24 h。用磁鐵收集反應(yīng)得到的PEI-BA-MNPs,洗滌3次后進行真空干燥。將獲得的PEI-BA-MNPs儲存以備進一步使用。對于BA-MNPs的合成,使用AMNPs代替PEI-MNPs,其余步驟保持不變。

1.3 磁性固相萃取過程

稱取3 mg的PEI-BA-MNPs,先加入0.5 mL空白溶劑(含30%甲醇和70% pH 8.5的磷酸鹽緩沖液),超聲使PEI-BA-MNPs均勻分散,再加入等量的人參皂苷標準溶液,混合均勻后,振蕩60 min,棄去上清液,用空白溶劑清洗,加入200 μL的0.1 mol/L乙酸,振蕩60 min,吸取上清液,在203 nm處測定紫外吸收度。

1.4 親和力測定

PEI-BA-MNPs對于人參皂苷的親和力采用Scatchard擬合進行分析。根據(jù)以下Scatchard方程計算解離常數(shù)(Kd)和表觀最大結(jié)合容量(Qmax):

Qe/Cs=(Qmax-Qe)/Kd

其中Qmax和Kd分別是飽和結(jié)合容量和解離常數(shù),Qe是人參皂苷在平衡時與PEI-BA-MNPs和BA-MNPs的結(jié)合量,Cs是吸附平衡時的自由濃度。Kd和Qmax的值可以根據(jù)Qe/Cs與Qe曲線的斜率和截距來計算。

1.5 啟脾口服液樣品預(yù)處理

本工作方法:將啟脾口服液用含30%甲醇和70% pH 8.5的磷酸鹽緩沖液稀釋100倍后,按照1.3節(jié)中所述過程進行萃取。

2015版《中國藥典》(ChP2015)標準方法:精密量取啟脾口服液50 mL,加入三氯甲烷振搖提取3次,每次30 mL,棄去三氯甲烷提取液,水液中加入水飽和的正丁醇振搖提取5次(50、30、30、20、20 mL),合并正丁醇提取液,加氨試液洗滌4次,每次50 mL,棄去氨試液,再加正丁醇飽和的水輕輕振搖洗滌2次,每次50 mL,棄去水洗液,正丁醇液回收溶劑至干,殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.6 高效液相色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-3色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm),檢測波長:203 nm,流速:1.3 mL/min。流動相為1%(v/v) H3PO4(A)和ACN(B),梯度如下:0～30 min, 19%B; 30～35 min, 19%B～24%B; 35～60 min, 24%B～40%B; 60～70 min, 40%B,進樣量為20 μL。所有流動相在使用前通過0.45 μm的濾膜過濾,并在超聲中脫氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性納米粒子的表征

用TEM對制備的PEI-BA-MNPs進行了形貌表征。如圖2a所示,TEM圖像顯示PEI-BA-MNPs具有良好的分散性和相對均勻的尺寸分布,平均直徑約為100 nm。如圖2b所示,PEI-BA-MNPs在水中均勻分散,并被外部磁鐵迅速吸引到容器壁上。當去除磁體時,聚集的納米粒子可以通過超聲重新分散。首先采用腺苷和脫氧腺苷這一對化合物對PEI-BA-MNPs的硼親和作用進行表征,按照1.3節(jié)中的方法對腺苷和脫氧腺苷標準溶液進行萃取和解吸,所得溶液在260 nm處測定紫外吸收度,結(jié)果(見圖2c)顯示腺苷的紫外吸收度遠大于脫氧腺苷,說明所合成的PEI-BA-MNPs對含有順二羥基分子具有選擇性。

2.2 磁性固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1吸附時間

吸附時間是固相萃取技術(shù)中的一個重要參數(shù),一般情況下,在吸附劑與目標物未達到結(jié)合平衡時,吸附劑的結(jié)合能力會隨著吸附時間的增加而增加,在保證富集效果的前提下,應(yīng)盡量縮短吸附時間。

按照1.3節(jié)中的過程進行萃取,如圖3a所示,分別考察了吸附時間為5、10、20、30、60、360 min時磁性納米粒子的結(jié)合能力,結(jié)果表明,在5～60 min內(nèi),隨著吸附時間的增加,磁性納米粒子的吸附能力逐漸增大;當吸附時間為60 min時,結(jié)合能力達到最大;之后隨著吸附時間增加,磁性納米粒子的結(jié)合能力變化不大。因此,本工作選擇60 min作為最佳吸附時間。

圖 2 PEI-BA-MNPs的(a)透射電子顯微鏡照片、(b)磁分離照片和(c)PEI-BA-MNPs結(jié)合腺苷、脫氧腺苷的能力考察(n=3)Fig. 2 (a) TEM image and (b) photographs of magnetic separation of PEI-BA-MNPs and (c) investigation on the binding affinity of PEI-BA-MNPs to adenosine and deoxyadenosine (n=3)

圖 3 (a)吸附時間和(b)解吸時間對PEI-BA-MNPs結(jié)合人參皂苷Re(1 g/L)容量的影響(n=3)Fig. 3 Effect of (a) adsorption time and (b) desorption time on the binding capacity of PEI-BA-MNPs towards ginsenoside Re (1 g/L) (n=3)

2.2.2解吸時間

如圖3b所示,分別考察了解吸時間為5、10、20、30、60、360 min時磁性納米粒子的結(jié)合容量,結(jié)果表明,在5～30 min內(nèi),隨著解吸時間的增加,磁性納米粒子的結(jié)合容量逐漸增大;當解吸時間為30 min時,結(jié)合能力達到最大;之后隨著解吸時間增加,磁性納米粒子的結(jié)合能力幾乎不再變化。因此,基于以上實驗結(jié)果,本工作選擇30 min為最佳解吸時間。

圖 4 (a) BA-MNPs與PEI-BA-MNPs對人參皂苷Re的等溫吸附線及(b)PEI-BA-MNPs對人參皂苷Re吸附的Scatchard分析(n=3) Fig. 4 (a)Adsorption isotherms of BA-MNPs and PEI- BA-MNPs towards ginsenoside Re and (b) Scatchard analysis of PEI-BA-MNPs towards ginsenoside Re (n=3)

2.3 親和力

以人參皂苷Re為例,對制得的PEI-BA-MNPs和BA-MNPs進行Scatchard分析,如圖4a所示,人參皂苷Re在平衡時與PEI-BA-MNPs的結(jié)合量Qe遠高于與BA-MNPs的結(jié)合量。

根據(jù)圖4b中的Scatchard分析,PEI-BA-MNPs的Kd值為(0.21±0.07) μmol/L;Qmax為(8.4±0.2) mmol/g。和硼酸與單糖的作用力相比[26,27],其對于人參皂苷的親和力有了明顯的增加,這為PEI-BA-MNPs用于人參皂苷高效富集提供了理論依據(jù)。

2.4 選擇性

本工作以人參皂苷Re和Rb1為代表,研究PEI-BA-MNPs的選擇性。在PEI-BA-MNPs結(jié)合了人參皂苷(Re或Rb1, 0.5 g/L)之后,將PEI-BA-MNPs加入高濃度的競爭物質(zhì)溶液(空白溶劑、葡萄糖、果糖、原人參三醇、原人參二醇,5 g/L)后振蕩1 h,隨后測定PEI-BA-MNPs對于人參皂苷(Re或Rb1)的吸附量。如圖5所示,PEI-BA-MNPs與Re或Rb1的結(jié)合基本不受干擾,將加入空白溶劑的吸附量設(shè)為100%,加入其他高濃度競爭物質(zhì)的吸附量均保持了原始吸附量的95%以上。對于葡萄糖、果糖而言,由于只具有一個順式二羥基結(jié)構(gòu),其與材料之間的親和力顯著弱于含多個順式二羥基結(jié)構(gòu)的人參皂苷。對于原人參三醇、原人參二醇而言,其不具有順式鄰二羥基結(jié)構(gòu),因而與材料之間無親和力。此現(xiàn)象為使用PEI-BA-MNPs對實際樣品中的人參皂苷進行選擇性富集提供了可能。

圖 5 競爭物質(zhì)對已結(jié)合人參皂苷Re和Rb1的PEI-BA-MNPs結(jié)合容量的影響(n=3)Fig. 5 Effect of competitive substances on the binding capacity of PEI-BA-MNPs towards ginsenosides Re and Rb1 (n=3)

圖 6 PEI-BA-MNPs重復(fù)使用次數(shù)與其結(jié)合容量的關(guān)系(n=3)Fig. 6 Relationship between the repeated times and binding capacities of PEI-BA-MNPs (n=3)

2.5 重復(fù)使用性

如圖6所示,以人參皂苷Re為例,PEI-BA-MNPs重復(fù)使用10次后,吸附容量雖然有所下降,但重復(fù)5次后仍保持在初始吸附容量的72.8%。造成此現(xiàn)象的原因可能是:在材料制備過程中,硼酸的修飾是依靠席夫堿反應(yīng)進行的,隨后C=N被還原為C-N以增加穩(wěn)定性。所得材料可能是存在未被還原的C=N,造成重復(fù)使用過程中硼酸被洗脫下來。此結(jié)果表明,PEI-BA-MNPs能在一定的使用次數(shù)內(nèi)維持良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性,后續(xù)需要繼續(xù)優(yōu)化材料制備過程以進一步提高材料的穩(wěn)定性。

2.6 方法驗證

在上述優(yōu)化條件下以人參皂苷Re和Rb1為代表,對該方法進行了評價。在50～800 μg/L范圍內(nèi)人參皂苷Re的峰面積y與質(zhì)量濃度x(μg/L)的線性回歸方程為y=419x+7 444,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9681,線性良好;人參皂苷Rb1的峰面積y與質(zhì)量濃度x(μg/L)的線性回歸方程為y=418x+8 011,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9799,線性良好。以S/N為3和10分別確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果為20 μg/L和50 μg/L。

實驗采用在陰性樣品中添加3種不同濃度的人參皂苷Re標準溶液,每個水平平行測定6次,測得方法的回收率和相對標準偏差(RSD),用以評價方法的準確性。所得結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,3種水平下的加標回收率為91.5%～117.3%,RSD為7.2%～13.4%。

表 1 樣品中人參皂苷Re的加標回收率及精密度(n=6)

圖 7 不同濃度人參皂苷Re采用不同預(yù)處理方法在儀器中的信噪比對比Fig. 7 Comparison of the S/N of ginsenoside Re with different concentration using different pretreatment methods in the instrument

此外,還以不同濃度的人參皂苷Re(10 μg/L、50 μg/L、500 μg/L、1 mg/L、10 mg/L、50 mg/L)為代表,對PEI-BA-MNPs磁性固相萃取和直接進標準樣兩種方式的信噪比進行了考察,如圖7所示,在直接進樣中,在1 mg/L時信噪比為7,接近檢出限。而經(jīng)過PEI-BA-MNPs磁性固相萃取后,使用同樣的儀器可以檢測到質(zhì)量濃度為20 μg/L的樣品。與直接進樣的分析方法相比,本方法的靈敏度提高了約50倍,說明PEI-BA-MNPs對人參皂苷Re有良好的富集作用。

圖 8 啟脾口服液經(jīng)由PEI-BA-MNPs富集前后的高效液相色譜圖Fig. 8 Comparison of high performance liquid chromato- gram of Qipi oral liquid before and after the selective enrichment of PEI-BA-MNPs

2.7 實際樣品中的應(yīng)用

啟脾口服液中含有人參皂苷成分,本工作選用啟脾口服液驗證上述方法在實際樣品中的應(yīng)用。啟脾口服液分別按照1.3節(jié)中所述方法和ChP2015中的標準方法進行處理。如圖8所示,富集后樣品的色譜圖中干擾成分的色譜峰顯著減少,可有效地提高樣品檢測的準確度。同時,本方法中的樣品前處理方法相較于ChP2015中有著極大的簡化[28]。最后,使用ChP2015標準方法進行對比,采用本方法測定的啟脾口服液中人參皂苷Re含量為0.27%,而ChP2015標準方法檢測出Re的含量為0.31%。結(jié)果顯示,采用本文中提出的樣品前處理技術(shù)富集人參皂苷能得到令人滿意的效果。

3 結(jié)論

本研究基于硼親和作用原理,合成了一種新型磁性納米顆粒PEI-BA-MNPs,其有均勻的尺寸大小、良好的磁性性能且制備方法簡單、分散性良好。將其作為磁性固相萃取吸附劑,結(jié)合高效液相色譜分析,建立了一種有效測定實際樣品中人參皂苷的方法,可以有效簡化藥典中復(fù)雜的樣品預(yù)處理步驟。本方法在針對皂苷類的藥物分析方面具有較高的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。