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2例Ⅲ型糖原累積病患兒基因型和表型分析

2021-05-07 04:17張志華鄭必霞
關(guān)鍵詞:基轉(zhuǎn)移酶糖原外顯子

張志華,鄭必霞,林 謙

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科,2兒科學(xué)重點實驗室,江蘇 南京 210008

糖原累積?、笮停╣lycogen storage diseases typeⅢ,GSDⅢ,MIM#232400)是一種常染色體隱性遺傳的糖代謝障礙疾病,由糖原脫支酶(glycogen debranching enzyme,AGL)基因先天性缺陷所致[1]。該酶在糖原分解中發(fā)揮α-1,4-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.25)和淀粉1,6-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.33)的作用。GSDⅢ患者AGL基因先天性缺陷,糖原支鏈不能完全被分解,導(dǎo)致帶短支鏈的異常糖原(極限糊精)堆積在肝臟、肌肉和心肌中,臨床主要表現(xiàn)為肝腫大、空腹低血糖和酸中毒等臨床癥狀和病理生化改變。本文報道2例2017年南京市兒童醫(yī)院確診GSDⅢ患兒AGL基因突變和臨床表型特點。

1 病例資料

病例1:患兒男,2歲1個月,因“發(fā)現(xiàn)腹圍增大1年余”入院。患兒家長1年前發(fā)現(xiàn)患兒腹圍漸增大,無腹痛,未予特殊處理。查體:身高85 cm,體重11.3 kg,在正常同齡兒童身高體重水平。肝臟肋下9 cm,劍突下7 cm,質(zhì)韌,脾臟肋下2 cm,質(zhì)韌,腹部無移動性濁音,腹股溝未發(fā)現(xiàn)異常,脊柱、四肢無畸形。查腹部B超示肝右葉斜徑119 mm,肋下89 mm,形態(tài)增大,肝功能示:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶864 U/L,天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1 250 U/L,谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶425 U/L,甘油三酯7.17 mmol/L,空腹血糖3.4 mmol/L,血糖監(jiān)測正常,乳酸脫氫酶708 U/L,肌酸激酶102 U/L。血氣分析顯示為代謝性酸中毒:pH 7.28,實際碳酸氫根濃度13.6 mmol/L,標(biāo)準(zhǔn)碳酸氫根濃度15.2 mmol/L。肝穿刺組織示正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失,肝細(xì)胞排列紊亂,肝細(xì)胞腫脹,胞漿空淡,核小,居中,部分細(xì)胞核大,空泡狀,匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤。電鏡下可見肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)糖原顆粒明顯增多,大片堆積,占據(jù)大部分胞質(zhì),形成糖原湖,線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯減少。心臟超聲未見異常。臨床診斷為糖原累積病,為明確其分型,遂進(jìn)行肝臟受累型糖原累積病基因檢測。

病例2:患兒女,年齡2歲7個月,因“發(fā)現(xiàn)肝功能異常1年余”入院。查體:體格發(fā)育落后,身高86 cm,體重11 kg,低于正常同齡兒童身高、體重2個標(biāo)準(zhǔn)差。輔助檢查:肝功能示,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶627.8 U/L,天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶536.7 U/L,總膽紅素13.7 μmol/L,直接膽紅素6.2 μmol/L,間接膽紅素7.5 μmol/L。入院后予阿拓莫蘭聯(lián)合復(fù)方甘草甜素保肝治療,監(jiān)測血糖提示晨起空腹血糖異常低下(2.2~2.5 mmol/L),予口服生玉米淀粉后空腹血糖正常?;純杭覍倬芙^進(jìn)行肝臟活檢,為明確診斷糖原累積病,遂進(jìn)行肝臟受累型糖原累積病基因檢測。

基因測序:患兒監(jiān)護(hù)人填寫知情同意書,本研究獲南京兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。收集患者靜脈抗凝血2 mL,使用全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)抽提患者及父母DNA,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用Primer5軟件設(shè)計引物擴(kuò)增G6PC、AGL基因編碼蛋白的所有外顯子及其側(cè)翼序列,由上海Invitrogen公司合成。采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,擴(kuò)增30個循環(huán);最后72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。PCR的體系均為50 μL。PCR產(chǎn)物純化回收后,以BigDye Terminator(Applied Biosystems公司,美國)進(jìn)行產(chǎn)物標(biāo)記,精制純化后用ABI Prism 3130 genetic analyzer測序。測序結(jié)果與Ensembl基因數(shù)據(jù)庫中G6PC(ENSG00000131482)和AGL(ENSG00000162688)基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對。AGL基因突變命名參照的轉(zhuǎn)錄本為NM_000028。

基因測序結(jié)果:病例1未篩查到糖原累積病Ⅰa型G6PC基因外顯子及其側(cè)翼序列突變。發(fā)現(xiàn)患兒AGL基因型結(jié)果為c.644A>T/c.655A>G復(fù)合雜合型突變(圖1A、B)。進(jìn)一步對其突變來源進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)其父親攜帶AGL基因c.655A>G雜合突變,母親攜帶c.644A>T雜合突變。c.644A>T系錯義突變,導(dǎo)致AGL蛋白第215位天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸(p.D215V),已有文獻(xiàn)在GSDⅢ患兒中檢測到該突變,為致病性突變。該突變未見數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報道。c.655A>G系錯義突變,導(dǎo)致AGL蛋白第219位天冬酰胺突變?yōu)樘於彼幔╬.N219D)。

病例2未篩查到糖原累積?、馻型G6PC基因外顯子及其側(cè)翼序列突變。發(fā)現(xiàn)患兒AGL基因型結(jié)果為c.3142_3158delinsAA純合突變(圖1C),該突變系缺失插入突變,推測導(dǎo)致AGL蛋白第1 048~1 053位氨基酸缺失,同時在該位置插入1個天冬酰胺(p.C1048_F1053delinsN)。進(jìn)一步對其突變來源進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)患兒父母均為c.3142_3158delinsAA突變攜帶者。該突變未見數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報道。

新發(fā)錯義突變致病性分析:病例2攜帶的p.N219D錯義突變?yōu)樾掳l(fā)突變,在大型正常人群測序數(shù)據(jù)庫ExAC和1000G中均未發(fā)現(xiàn)該突變。我們利用ConSurf(http://consurftest.tau.ac.il)對該突變所在氨基酸位點保守性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)219位天冬酰胺為高度保守區(qū)。Polyphen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)軟件預(yù)測顯示其為可能致病性突變(圖2)。同時SIFT和Mutationtaster網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果也均顯示該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔儭?/p>

近期隨訪,2例病例患兒均定期消化科及營養(yǎng)科門診隨訪,生玉米淀粉飲食(1.5~2.0 g/kg,每天4次)及高蛋白低糖飲食治療中。病例1患兒已4歲7個月,血糖監(jiān)測正常,體格發(fā)育同正常同齡兒童,2019年11月復(fù)查肝臟超聲提示肝腫大好轉(zhuǎn),肝右葉斜徑95 mm,肋下5 mm。病例2患兒已5歲2個月,血糖控制基本良好,但偶有夜間空腹低血糖,近期心臟超聲提示心室輕度肥厚,心功能正常。目前身高105 cm,體重16 kg,較正常同齡兒童低1個標(biāo)準(zhǔn)差。

2 討論

圖1 GSDⅢ患兒AGL基因突變測序圖

圖2 新發(fā)錯義突變p.N219D生物信息學(xué)預(yù)測

1992年美國學(xué)者Yang-Feng等成功將人類AGL基因定位于1號染色體短臂的2區(qū)1帶(1p21),AGL基因全長85 kb包括35個外顯子,在肝臟編碼的mRNA長度7.4 kb,AGL mRNA包括編碼翻譯區(qū)(4 596 bp)和3′端非翻譯區(qū)(2 371 bp);其轉(zhuǎn)錄起始點為第3外顯子的第69個堿基,終止密碼子位于外顯子35,AGL單體蛋白包含1 532個氨基酸,分子量為170 kDa[2]。迄今為止人類基因突變數(shù)據(jù)庫中共收錄了162種AGL基因突變,包括錯義突變、無義突變、缺失突變、剪切位點突變、重復(fù)突變等[3-4]。AGL酶蛋白有3個重要的結(jié)構(gòu)功能域,糖原結(jié)合區(qū)位于羧基外顯子31~34區(qū)域內(nèi),它不僅能結(jié)合底物,也是穩(wěn)定酶蛋白構(gòu)象的重要結(jié)構(gòu);α-1,4-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性功能域由外顯子6和外顯子13~15的Asp535、Glu564、Asp670位點構(gòu)成;淀粉1,6-葡萄糖苷酶的活性與外顯子26、27的Asp1089、Asp1147位點密切相關(guān)[5]。

本研究中病例1攜帶AGL基因p.D215V/p.N219D復(fù)合雜合型突變,p.N219D錯義突變?yōu)樾掳l(fā)突變,在大型正常人群測序數(shù)據(jù)庫ExAC和1000G中均未發(fā)現(xiàn)該突變。蛋白質(zhì)保守性分析顯示該位點為高度保守區(qū),同時經(jīng)Polyphen2和SIFT軟件預(yù)測顯示其為可能致病性突變。既往文獻(xiàn)報道攜帶純合突變姐妹,同樣沒有低血糖表現(xiàn)[6],提示p.N219D錯義突變可能為更輕表型相關(guān)的錯義突變。在Shaiu等[7]報道的1例攜帶IVS32-12A>G純合突變的糖原累積病患者同樣沒有低血糖表現(xiàn),臨床表型輕,僅表現(xiàn)為肝臟腫大,無肌肉組織受累情況。本研究中的病例2嚴(yán)重低血糖發(fā)作,同時伴有磷酸肌酸激酶增高。病例2攜帶AGL基因c.3142_3158delinsAA純合突變基因型,未見數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報道該突變,c.3142_3158delinsAA推測造成AGL酶蛋白多個氨基酸缺失。GSDⅢ患兒在嬰兒期表現(xiàn)出肝大,反復(fù)發(fā)作的低血糖也是主要表現(xiàn),GSDⅢ是糖原脫支酶缺陷所致,其中以同時累及肝臟和肌肉的Ⅲa型最多見,不累及腎臟。由于不影響糖異生,故嚴(yán)重低血糖少見[7-8]。我國郭麗等[9]報道1例AGL基因型為c.3710-3711delTA/IVS14+1G>T的患兒,在25月齡時表現(xiàn)為低血糖抽搐。該課題組在2017年又報道的一家系2例患兒均在1歲左右出現(xiàn)嚴(yán)重低血糖抽搐,該家系基因型為c.1735+1G>T和c.959-1G>C,均為經(jīng)典剪切位點突變[10]。以上患兒攜帶的基因突變類型均為造成蛋白翻譯提前終止的移碼突變或剪切突變,可能對酶活性的影響更為嚴(yán)重。本研究中的病例2為c.3142_3158delinsAA純合突變,涉及多個氨基酸的缺失,可能同為更嚴(yán)重表型相關(guān)的突變類型??傊?,GSDⅢ患兒臨床表型嚴(yán)重不一,非??赡芘c基因型相關(guān),但進(jìn)一步分子機(jī)制需要突變功能研究。

綜上,本研究通過對2例糖原累積病患者進(jìn)行AGL基因測序分析,發(fā)現(xiàn)了3種致病突變,其中p.N219D和c.3142_3158delinsAA為新發(fā)突變,綜述文獻(xiàn)報道的相關(guān)病例,p.N219D變異可能關(guān)聯(lián)較輕臨床表型,而c.3142_3158delinsAA變異可能和更嚴(yán)重的表型相關(guān)。AGL的基因診斷可為GSDⅢ患者的治療、預(yù)后評估和家系產(chǎn)前診斷等提供重要依據(jù)。

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