謝曉剛，李 丹，羅 艷，賈燕青，薛增迪，張振倉，馬乃祥，權(quán)富生*

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學院動物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技學院動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

奶牛乳腺炎(Cow mastitis)是指奶牛乳腺組織代謝紊亂，或者受到物理或化學刺激后對病原微生物入侵易感而造成的炎癥，是奶牛養(yǎng)殖場中的常見病和多發(fā)病，會影響奶牛產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì)，嚴重時病牛會面臨被淘汰的風險，給奶牛業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。在畜牧生產(chǎn)上，造成奶牛乳腺炎的病原微生物主要有大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。大腸埃希氏菌廣泛存在于糞便、墊料以及飼料中，若工作人員在擠奶過程中操作不當，會造成大腸埃希氏菌入侵乳房引發(fā)急性乳腺炎；而金黃色葡萄球菌具有一定的黏附性，常通過皮膚傳播，最后定植于乳腺上皮細胞，產(chǎn)生腸毒素等導致宿主細胞過度表達炎性介質(zhì)造成持續(xù)的炎癥反應，引起慢性乳腺炎[2-4]。因此，研究奶牛乳腺炎致病機理對臨床生產(chǎn)上防控乳腺炎尤為重要。

circRNA是pre-mRNA的反向剪切或外顯子跳躍產(chǎn)生的首尾相接的單鏈閉合環(huán)狀分子[5]，其具有多種生物學功能，如調(diào)節(jié)自身基因的表達[6]；調(diào)節(jié)mRNA的可變剪切、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)翻譯過程[7]；作為microRNA的“分子海綿”[8]；作為蛋白海綿或蛋白支架[6]；還可以翻譯成蛋白或多肽[9]。此外，有一些假基因也來源于circRNA[10]。但circRNA在牛上的研究主要集中在作為“分子海綿”調(diào)節(jié)成肌細胞的增殖、分化與凋亡[11-13]，參與牛睪丸發(fā)育和精子發(fā)生[14]，也可能參與酪蛋白基因表達的調(diào)節(jié)[15]。之前也有相關(guān)circRNA在奶牛乳腺炎中作用的相關(guān)分析，證明circRNA參與了奶牛乳腺炎的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究從前期高通量測序結(jié)果中篩選到一個名為circRNAcirc0000316的circRNA[16]，并通過大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌誘導建立奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型，采用RT-PCR方法檢測circ0000316在該模型中的表達情況，為進一步研究環(huán)狀RNA在奶牛乳腺炎進程中的作用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 由病理專業(yè)人員將現(xiàn)代牧業(yè)(寶雞牧場)中明顯患有乳腺炎病變和泌乳中后期因意外(如發(fā)生骨折等疾病)而淘汰的健康奶牛的乳腺組織取樣送到實驗室，經(jīng)病理學鑒別診斷后確定患有乳腺炎，病料經(jīng)40 mL/L福爾馬林及9 g/L生理鹽水處理后，一部分于-80℃保存，一部分用于后期試驗。

1.1.2 細胞和菌種 奶牛乳腺上皮細胞系(MAC-T細胞)以及本研究中所用大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌均由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 Trizol up試劑盒、TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑，均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；牛腫瘤壞死因子(TNF-α)檢測試劑盒，上?？道蕦崢I(yè)有限公司產(chǎn)品；DMEM/DF12培養(yǎng)基，美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，以色列BI公司產(chǎn)品；試驗過程中所用到的引物，均由北京擎科公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.1.4 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司產(chǎn)品；多功能酶標檢測儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；Real-time quantitative PCR儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 組織和細胞RNA提取 本試驗采用Trizol法提取組織總RNA。對于組織樣品，將黃豆大小的組織樣品剪碎后放入液氮預冷的研缽中，將組織塊研細，加入1 mL Trizol up試劑反復吹吸，使組織樣品充分裂解，依照說明書提取組織或細胞總RNA，酶標儀檢測所得RNA質(zhì)量和濃度，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞樣品經(jīng)處理后，棄去上清，經(jīng)PBS沖洗后加入適量Trizol up試劑，使細胞充分裂解后依據(jù)說明書提取細胞總RNA，酶標儀檢測所得RNA質(zhì)量和濃度，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR檢測 按照北京全式金公司TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應步驟如下：在無RNase的EP管中，分別加入總RNA 1 μg、Random Primer(N9)和TransScript?RT/RI Enzyme Mix各1 μL，2×TS Reation Mix 10 μL，加Nuclease-Free Water補至20 μL，輕輕混勻后，25℃孵育10 min，42℃孵育15 min，85℃加熱5 s失活TransScript?RT/RI，反應結(jié)束后將cDNA置于-20℃?zhèn)溆谩２捎肧YBR方法檢測mRNA表達情況，反應體系與步驟如下：在無RNase的EP管中，分別加入2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-Free Water補至20 μL，輕輕混勻后，進行離心，避免管壁和管蓋沾有液體而影響試驗結(jié)果，每孔3個重復。PCR程序為：95℃ 5 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)進行擴增；95℃ 15 min，60℃ 1 min，±5℃進行梯度升溫至95℃，持續(xù)15 s，程序結(jié)束后對目的基因的表達量進行分析。

1.2.3 大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌滅活 參照Ma等[17]的試驗方法，首先對細菌進行培養(yǎng)，將保存于-80℃的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌分別劃線接種于不含抗生素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃倒置培養(yǎng)14～16 h，待培養(yǎng)基中長出單菌落，并將1 mm～2 mm的單菌落用接種針接種于15 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，待細菌生長至對數(shù)期，收集菌液備用。將收集后的菌液分別進行10倍稀釋至102、104、106后，分別吸取不同稀釋度的菌液10 μL接種至LB固體培養(yǎng)基中，每個稀釋度做3個重復，37℃倒置培養(yǎng)12 h～14 h，待培養(yǎng)基長出清晰可見的單菌落時，對單菌落數(shù)在50～200之間的稀釋度進行計數(shù)，依據(jù)文獻中的計算公式對細菌數(shù)量進行統(tǒng)計。將收集后的菌液在超凈臺中分裝至2 mL無菌離心管中，做好標記并封口。采用低溫滅活的方式對細菌進行滅活，依據(jù)文獻中的描述，大腸埃希氏菌的滅活條件為：65℃水浴1 h，金黃色葡萄球菌為60℃水浴2 h。滅活后對菌液進行滅活檢驗，檢驗方法為：吸取10 μL滅活后的菌液，接種至LB固體培養(yǎng)基中倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察培養(yǎng)基中是否長出單菌落，若未長出則滅活成功，將滅活成功的單菌落于-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 炎性細胞模型的建立 將生長良好的MAC-T細胞消化收集后，用DF12培養(yǎng)液重懸進行細胞計數(shù)，計數(shù)后將細胞接種于60皿中，每皿細胞數(shù)約為4×105個，培養(yǎng)細胞至貼壁；將預先滅活并計數(shù)的菌液收集離心，PBS清洗2次后細胞培養(yǎng)液重懸，大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌分別以1 000∶1和100∶1的比例對細胞進行攻菌，處理24 h后分別收集上清和細胞，總RNA進行下一步試驗。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ①試驗前準備：將試劑盒平衡至室溫后，20倍濃縮洗滌液于37℃水浴助溶；②收集處理后細胞上清至無菌離心管，2 500 r/min離心20 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管；③加樣：設置空白孔，標準孔和待測樣品孔，空白孔不加樣品及酶標試劑，每個標準孔加不同濃度的標準品50 μL，樣品孔中，樣品稀釋液40 μL+待測樣品10 μL(樣品稀釋5倍)；④加酶孵育：除空白孔外，每孔加入酶標試劑100 μL，封板膜封板，37℃孵育60 min；⑤洗板：20倍濃縮洗滌液蒸餾水稀釋20倍，揭掉封板膜棄去試劑，甩干，每孔加滿洗滌液(約350 μL)，靜置30 s棄去，重復5次，拍干；⑥顯色：每孔先加顯色劑A 50 μL，再加50 μL顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，封板37℃避光顯色15 min；⑦終止：每孔加入終止液50 μL終止反應；⑧測定：終止液加入15 min后，450 nm波長測定各孔吸光度。

1.2.6 統(tǒng)計分析 本研究中的試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差(SD)”形式呈現(xiàn)，每個試驗結(jié)果均重復3次，統(tǒng)計學差異由雙尾t檢驗所得，*P<0.05認為統(tǒng)計學差異顯著，**P<0.01認為統(tǒng)計學差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 circ0000316在健康乳腺組織及炎性乳腺組織中的表達

本研究前期從現(xiàn)代牧業(yè)(寶雞牧場)獲得了3頭健康奶牛和3頭患乳腺炎奶牛的乳腺組織，分別提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后采用實時熒光定量PCR檢測circ0000316的表達量，結(jié)果顯示circ000316在炎性組織中的表達量顯著降低(圖1A和圖1B)。

A.炎性組織和正常組織中circ0000316的表達(n=3)；B.炎性組織和正常組織中circ0000316表達的統(tǒng)計學分析。**P<0.01

2.2 奶牛乳腺炎細胞模型的建立

參考文獻中建立奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型的方法，以大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌刺激MAC-T細胞后，TNF-α顯著升高為作為模型建立成功的標志，因此本研究從mRNA和蛋白分泌水平檢測了TNF-α的變化，結(jié)果顯示TNF-α表達量顯著升高(圖2A和2B)，表明炎癥模型建立成功。

A.大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌刺激前后TNF-α基因表達情況；B.大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌刺激后TNF-α分泌水平

2.3 circ0000316在奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型中的表達

在成功建立奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型后，本研究繼而檢測了circ0000316在該模型中的表達量，結(jié)果顯示，circ0000316在奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型中呈現(xiàn)顯著低表達(圖3)，與前面提到的組織中的表達情況一致。

圖3 circ0000316在奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型中的表達量

3 討論

本研究參考Ma等[16]的方法以炎性標志性因子TNF-α升高為標志，建立了大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌刺激的奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型，模擬奶牛發(fā)生乳腺炎時的細胞環(huán)境，驗證circ0000316在奶牛乳腺上皮細胞炎癥模型中的表達情況。結(jié)果顯示，與奶牛乳腺組織中的表達趨勢一致，也與文獻中報道的高通量測序結(jié)果中circ0000316的表達趨勢相一致[17]。此外，有研究表明，circKIKA通過miR-326的“分子海綿”作用參與調(diào)控MAC-T細胞的凋亡和增殖[18]；而circLPP通過“分子海綿”作用降低游離miR-615的表達，導致miR-615對其靶基因SPRED3的穩(wěn)定性降低，從而參與調(diào)控奶牛乳腺組織的炎癥進程[19]。

本研究在大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌誘導的乳腺炎模型中驗證了circ0000316的表達情況，為深入研究circ0000316在奶牛乳腺炎發(fā)生過程的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)，為進一步研究奶牛乳腺炎的防控提供了新思路。