吳圓圓,屈勇剛*,于會舉,谷思穎,魏 其,梁 晏,吳 勤,張湘莉蘭,童貽剛

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003；2.石河子大學(xué)分析測試中心，石河子 832003；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071；4.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌屬(Escherichia)成員之一[1]，一般不致病，多為條件致病菌。1894年，首次有了關(guān)于雞大腸埃希氏菌的報道，隨后世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達國家和地區(qū)逐漸有了關(guān)于大腸桿菌病不同病型的報道[2-5]，由多種致病因子結(jié)合的禽致病性大腸埃希氏菌(Avian pathogenicE.coli,APEC)，可導(dǎo)致禽類的多種癥狀，最常見的是死胚、敗血癥、心包炎、卵黃性腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、氣囊炎、肉芽腫等[6-7]。由于臨床上抗菌藥物的長期、不合理使用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷增多[8]。因此，急切地需要新型藥物的研發(fā)，以控制耐藥性致病菌引起的感染。噬菌體是一種廣泛存在于自然界中的病毒，對其宿主菌具有高效特異性的感染，并且不出現(xiàn)耐藥性。近年來噬菌體已應(yīng)用于臨床疾病的治療，并具有良好的效果[9-13]。在現(xiàn)今雞大腸桿菌病治療的基礎(chǔ)上，筆者以本實驗室前期分離得的雞致病性大腸埃希氏菌為宿主菌分離噬菌體，經(jīng)過篩選得到一株裂解性噬菌體，分析了其部分其生物學(xué)特征，并進行了全基因組測序及分析，為該噬菌體用于臨床治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和水樣 45株雞大腸埃希氏菌均由石河子大學(xué)動物傳染病實驗室分離鑒定與保存，污水采于石河子市及周邊養(yǎng)雞場。

1.1.2 主要試劑 DNaseI、RNase A、Mung Bean Nuclease、病毒總基因提取試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；PEG4000為天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心產(chǎn)品；SM緩沖液、PBS緩沖液、LB的液體/半固體/固體培養(yǎng)基均在石河子大學(xué)動科院傳染病實驗室進行常規(guī)配制所得。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(Multifuge XLR)，美國賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(HT7700)，日立(中國)有限公司產(chǎn)品；測序儀(Miseq)，美國Illumina公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 宿主菌的準(zhǔn)備 將本實驗室保存于-80℃超低溫冰箱中的45株雞大腸埃希氏菌置于4℃環(huán)境下解凍。挑取在LB固體平板上劃線生長出的單一菌落分別接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37℃、160 r/min條件下過夜富集培養(yǎng)，后置4℃保存。

1.2.2 噬菌體的分離與純化 參考文獻[14-15]方法將污水水樣依次經(jīng)過無菌紗布和濾紙過濾，得到的濾液置于4℃過夜后，再用0.22 μm濾膜過濾除菌。取除菌的污水濾液與45株雞大腸埃希氏菌各菌懸液依次加于液體LB培養(yǎng)基中，于錐形瓶中混勻，室溫靜止15 min，37℃、160 r/min培養(yǎng)7 h并于4℃過夜，10 000 r/min離心10 min，取上清液分別與45株雞大腸埃希氏菌菌懸液混合吸附后，用雙層瓊脂平板法過夜培養(yǎng)進行噬菌體的分離。

用無菌牙簽挑取生長良好的單個噬菌空斑至于100 μL相應(yīng)宿主菌，吸附反應(yīng)15 min，加入5 mL 液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5 h，將離心倍比稀釋的培養(yǎng)液與宿主菌混合均勻后采用雙層瓊脂法培養(yǎng)，如此過程重復(fù)3次以上，直至在一個平板上形成形態(tài)單一的噬菌斑。即可得到純的噬菌體原液，將其置于-80℃(與500 mL/L甘油等體積混勻)保存和4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 噬菌體的濃縮及電鏡觀察 參考文獻[16]，采用超速離心法，進行噬菌體濃縮，將裂解液上清在4℃下24 446×g，離心1.5 h，用 SM緩沖液輕輕洗脫重懸每個離心管中的沉淀，最后將得到的濃縮液收集在1.5 mL無菌離心管中保存于-80℃?zhèn)溆?。?0 μL噬菌體濃縮液滴于載玻片上，用精細鑷子輕輕夾取銅網(wǎng)(200目)放于噬菌體濃縮液液滴上，室溫下吸附2 min后取出，放于吸水紙上，去除銅網(wǎng)上的液體，滴一滴20 g/L的磷鎢酸染液在銅網(wǎng)上，靜置染色3 min取出，放于吸水紙上，用紅外燈照射30 min，以徹底除去水分與有害雜質(zhì)后，用HT7700透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)。

1.2.4 噬菌體核酸類型的鑒定 噬菌體基因組的提取嚴(yán)格按照病毒基因DNA/RNA提取試劑盒說明書中的操作步驟進行，將提取的核酸于37℃水浴條件下，用DNase Ⅰ、RNase A與Mung Bean Nuclease分別對噬菌體的基因組消化2 h后，采用瓊脂凝膠電泳法對消化產(chǎn)物進行檢測。

1.2.5 噬菌體全基因組的測序 將噬菌體基因組處理為約290 bp的測序文庫，利用Miseq測序儀完成測序工作，使用軟件Newbler 2.9與CLC 3.0對得到的基因組序列進行序列組裝。測序工作由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物學(xué)流行病學(xué)研究所完成。利用MEGA7.0對所得序列進行親緣關(guān)系的構(gòu)建。

1.2.6 噬菌體裂解譜的測定 取100 μL噬菌體原液以1∶1分別與被調(diào)查的45株雞大腸埃希氏菌菌懸液吸附反應(yīng)15 min,雙層瓊脂法過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.2.7 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)的測定 將宿主菌培養(yǎng)至OD600≈0.5(對數(shù)生長期)，以固定的對數(shù)宿主菌液(100 μL)，按照感染復(fù)數(shù)分別為0.000 000 1、0.000 001、0.000 01、0.000 1、0.001、0.01、0.1、1的比例加入相應(yīng)體積的噬菌體液并混勻，靜置吸附15 min，均補加LB液體培養(yǎng)基至2 mL，振蕩培養(yǎng)4 h。10 000 r/min離心10 min，取上清，10倍倍比稀釋后，與培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液混合吸附，用雙層瓊脂法測定上述比例培養(yǎng)液的噬菌體滴度，滴度最高者即為最佳MOI。

1.2.8 噬菌體一步生長曲線的測定 將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液(100 ml)與噬菌體液按MOI=0.001混勻，并在靜置吸附20 min后補加LB至200 mL，此為時間0，37℃、160 r/min，在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、110 min、130 min、150 min、170 min、190 min、210 min，19個時間點各取2 mL，離心、稀釋、吸附，做3次重復(fù)試驗，每次2個平行，采用雙層瓊脂法測定噬菌體滴度，并根據(jù)滴度繪制噬菌體感染宿主菌的一步生長曲線。

1.2.9 噬菌體pH敏感性的測定 取100 μL噬菌體液分別接種于900 μL不同pH(pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)的LB液中，37℃水浴孵育2 h，稀釋、吸附，用雙層瓊脂法測定噬菌體滴度。觀察噬菌體的生長情況，繪制曲線。

1.2.10 噬菌體耐熱穩(wěn)定性的測定 分別取300 μL 效價為5.5×109PFU/mL的噬菌體原液于若干滅菌離心管中，將之分別置于40、50、60、70、80℃條件下處理，在0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min、160 min、180 min，10個時間點取樣并迅速放置于4℃，稀釋、吸附、倒板，測定其不同溫度下、不同時間點噬菌體的滴度，繪制熱穩(wěn)定性曲線。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離與純化

本試驗以45株雞大腸埃希氏菌與污水水樣共培養(yǎng)，采用雙層瓊脂平板法經(jīng)5次反復(fù)純化，在平板上生長的噬菌斑形態(tài)、大小均單一，得到1株裂解性噬菌體，其噬菌斑形態(tài)和大小見圖1，噬菌斑呈透亮的圓形，直徑0.8 mm～1.1 mm，邊緣整齊無暈環(huán)，將此噬菌體命名為vB-EcoM-IME540。

圖1 噬菌體vB-EcoM-IME540的噬菌斑形態(tài)

2.2 噬菌體的電鏡形態(tài)

透射電鏡觀察結(jié)果，如圖2所示，噬菌體vB-EcoM-IME540的頭部呈橢圓形且尾部具有收縮性，頭尾被頸圈分開，頭大小約106.7 nm×73.3 nm，尾長約140 nm×16.7 nm。根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)在2011年發(fā)布的第9次報告中噬菌體的分類與命名標(biāo)準(zhǔn)，噬菌體vB-EcoM-IME540屬有尾噬菌體目(Caudovirales)，肌尾噬菌體科(Myoviridae)。

圖2 噬菌體vB-EcoM-IME540的透射電鏡照片

2.3 噬菌體的核酸類型鑒定

噬菌體核酸瓊脂凝膠電泳結(jié)果，如圖3所示，噬菌體vB-EcoM-IME540的核酸只能被DNase Ⅰ消化，卻不能被RNase A與Mung Bean Nuclease消化，表明該噬菌體核酸為雙鏈DNA(Double-stranded DNA,dsDNA)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.vB_EcoM-IME540核酸；2.DNase Ⅰ；3.RNase A；4.Mung Bean Nuclease

2.4 噬菌體的全基因組測序及親緣性分析

由測序結(jié)果可知，噬菌體vB-EcoM-IME540的全基因組大小為170 237 bp，G+C含量為39.46 %，在DNAMan上序列組成分別為A:30.7%、C:19.1%、G:20.3%、T:29.8%，由此可知此噬菌體的核酸類型為dsDNA。利用MEGA7.0.26與NCBI上基因庫中的親緣噬菌體進行基因比對，制作其系統(tǒng)進化樹如圖4，通過Blastn發(fā)現(xiàn)vB-EcoM-IME540與NCBI上發(fā)布的大腸桿菌噬菌體Bp7的相似性為97.44%(Bp7的GenBank登錄號為NC019500.1)，并已知大腸桿菌噬菌體Bp7是肌尾科噬菌體，結(jié)合電鏡形態(tài)觀察可將噬菌體vB-EcoM-IME540歸類為肌尾噬菌體家族。

圖4 噬菌體vB_EcoM_IME540的系統(tǒng)進化樹

2.5 噬菌體的裂解譜

噬菌體vB-EcoM-IME540與45株雞大腸埃希氏菌作用，測定其裂解譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體vB-EcoM-IME540只對其中3株雞大腸埃希氏菌有裂解作用，裂解率約為6.67%(3/45)。

2.6 噬菌體的最佳MOI

不同比例的噬菌體與宿主菌反應(yīng)時，子代噬菌體的產(chǎn)生情況也大不相同，試驗結(jié)果表明，當(dāng)MOI=0.000 001時，產(chǎn)生的子代噬菌體滴度最高，見圖5。因此，噬菌體vB-EcoM-IME540感染宿主菌的最佳MOI為0.000 001。

圖5 噬菌體vB-EcoM-IME540的感染復(fù)數(shù)

2.7 噬菌體的一步生長曲線

裂解性噬菌體的感染過程經(jīng)歷吸附、穿入、合成與裂解釋放4個階段，可用一步生長曲線進行描述與展示。從圖6可以清晰地看出，噬菌體vB-EcoM-IME540增殖的潛伏期、裂解期、平穩(wěn)期以及裂解量；其中潛伏期大約為20 min，裂解爆發(fā)期約為130 min，裂解量約為23 PFU/cell；大約在噬菌體感染宿主菌的150 min進入平穩(wěn)期，此時宿主菌全部裂解，噬菌體數(shù)量達到最高。

圖6 噬菌體vB-EcoM-IME540的一步生長曲線

2.8 噬菌體的pH敏感性

由圖7可知，噬菌體vB-EcoM-IME540在pH為4.0～13.0之間對噬菌體的影響不大，其效價無明顯變化并保持在較高水平。在pH為3.0時其活性明顯降低，在2.0時失去活性；在pH為13.0時，效價仍處于較高水平且明顯高于3.0，說明噬菌體vB-EcoM-IME540具有強耐堿性。

圖7 噬菌體vB-EcoM-IME540的pH敏感性

2.9 噬菌體的耐熱穩(wěn)定性

由圖8可知，噬菌體vB-EcoM-IME540在40℃、50℃條件下作用2 h時，噬菌體效價大約下降了13.0%；60℃作用2 h，大約下降了49.0%；70℃作用20 min，效價下降了60.0%；80℃作用20 min，噬菌體失活。

圖8 噬菌體vB-EcoM-IME540的耐熱穩(wěn)定性

3 討論

噬菌體與其細菌宿主的進化密切相關(guān)，并經(jīng)常提供毒力因子，使得噬菌體的研究對于理解致病株的進化具有重要意義。本試驗利用噬斑形成試驗與雙層瓊脂平板培養(yǎng)法從污水中分離、純化裂解性雞大腸埃希氏菌噬菌體，并將其暫時命名為vB-EcoM-IME540，其代表意義可參考張倩等[17]對其的解釋。

通過對噬菌體電鏡觀察、全基因組測序的比對和聚類分析知噬菌體vB-EcoM-IME540與噬菌體Enterobacteriaphage Bp7(有尾噬菌體目的肌尾噬菌體)親緣性最好，其全基因組序列覆蓋率高達 97%。在國際病毒分類委員會(ICTV)的最新報道中，又將此噬菌體劃分為dsDNA病毒。噬菌體vB-EcoM-IME540在pH為5.0～13.0時均有很高的活性，與孫利廣[18]等報道的V-EcoM-C1(pH5.0～10.0)相比，具有較強耐堿性；在50℃內(nèi)具有穩(wěn)定的活性，70℃下40 min仍具有活性，與本實驗室分離的噬菌體EcP5[19]相比有一定耐高溫性；裂解范圍與王禮偉[20]分離的EcP10相比較窄，因僅對本實驗室分離保存的雞源大腸埃希氏菌進行了裂解譜測定試驗，而對其他種源大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等菌屬是否具有裂解能力尚不清楚，需要進行后續(xù)的試驗加以驗證分析。感染宿主菌的潛伏期約為20 min，暴發(fā)期時間維持約130 min，裂解量23，具有較強的裂解活性；在較低的最佳感染復(fù)數(shù)0.000 001時，有較高的殺菌效率。綜合以上信息，本次試驗中分離的噬菌體vB-EcoM-IME540是一株能裂解雞大腸埃希氏菌的有尾噬菌體目肌尾噬菌體科的dsDNA噬菌體，有一定的臨床應(yīng)用價值。