李翔 張穎 黃亞琳 吳眾 郭浩軼

河南省人民醫(yī)院 河南省立眼科醫(yī)院 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院眼科，鄭州 450003

年齡相關(guān)性白內(nèi)障是導(dǎo)致老年人群盲的重要原因。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致白內(nèi)障的主要因素，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)的通透性及蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致晶狀體混濁[1-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是非編碼RNA，通過與靶基因的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)的互補(bǔ)序列結(jié)合而刺激或抑制靶基因的翻譯[4]。近年來發(fā)現(xiàn)多種miRNA在LECs的氧化應(yīng)激損傷過程中發(fā)揮作用，參與白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展[5-6]，此外，miRNA 125b(miR-125b)在多種細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用[7-8]，推測其可能參與人LECs的氧化應(yīng)激過程，但目前尚未得到證實(shí)。本研究探討miR-125b對年齡相關(guān)性白內(nèi)障LECs抗氧化應(yīng)激能力的作用及其可能的作用機(jī)制，為白內(nèi)障的防治尋找潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1晶狀體前囊膜組織標(biāo)本的收集 收集2018年7月至2019年3月于河南省立眼科醫(yī)院行白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)的單純性年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者24例24眼，其中男10例10眼，女14例14眼；年齡54～73歲，平均(64.32±7.93)歲，于手術(shù)中收集晶狀體前囊膜組織；同時收集河南省立眼科醫(yī)院眼庫的供體晶狀體前囊膜組織20例20眼，其中男9例9眼，女11例11眼；年齡52～70歲，平均(61.28±8.21)歲。本研究標(biāo)本提供者或其家屬均簽署知情同意書，本研究方案及標(biāo)本使用經(jīng)河南省立眼科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批文號：YKYY20193151)。

1.1.2細(xì)胞來源、主要試劑及儀器 永生化人LECs系(HLEB-3)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。miR125b擬似物、miR-125b抑制物和miR-125b對照序列均由上海吉瑪基因公司合成；CCK-8試劑盒(杭州四季青公司)；LipofectamineTM2000、Trizol、兔源核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)多克隆抗體(PA5-68817)、山羊抗兔IgG(H+L)二抗(A32731)、山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(A32723)、兔源Nrf2熒光一抗(710574)、鼠源Keap1熒光一抗(MA5-17106)(美國Invitrogen公司)；DAPI染色液(北京索萊寶公司)；DCFH-DA活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)熒光探針(北京百奧萊博科技有限公司)；總抗氧化能力(total-antioxidative capability，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(glutathone，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(上海碧云天有限公司)。免疫熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；紫外分光光度計(jì)(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的制備 將凍存的HLEB-3細(xì)胞解凍、復(fù)蘇，重懸于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和含青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至約80%時傳代，按照培養(yǎng)基中添加H2O2濃度不同將細(xì)胞分為100、200和400 μmol/L H2O2組，對照組加入不含H2O2的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取處于對數(shù)生長期的HLEB-3細(xì)胞以2×105個/孔細(xì)胞密度接種于6孔板，分別使用含有miR-125b擬似物、miR-125b對照和miR-125b抑制物序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將細(xì)胞分為miR-125b擬似物組、miR-125b對照組和miR-125b抑制物組。按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說明書中所示步驟，分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h，將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3應(yīng)用DCFH-DA熒光探針檢測各組細(xì)胞中內(nèi)源性ROS含量 取處于對數(shù)生長期的HLEB-3細(xì)胞以1×104個/孔細(xì)胞密度接種于96孔板，將細(xì)胞按照1.2.1描述的方法制備氧化應(yīng)激模型，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針溶液，培養(yǎng)箱中孵育20 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞，多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度值，即為細(xì)胞內(nèi)ROS含量，用激光掃描共焦顯微鏡拍照，激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞中ROS含量檢測方法同上。

1.2.4ELISA法檢測T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH活性及MDA濃度 將處于對數(shù)生長期的HLEB-3細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板，將細(xì)胞按照1.2.1描述的方法制備氧化應(yīng)激模型，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用相應(yīng)試劑盒說明書中的步驟測定細(xì)胞中T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH活性和MDA濃度。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用上述方法檢測細(xì)胞T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH活性和MDA濃度。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄PCR法測定晶狀體前囊膜組織標(biāo)本和HLEB-3細(xì)胞內(nèi)miR-125b表達(dá) 取白內(nèi)障患者和正常供體晶狀體前囊膜組織標(biāo)本，收集對照組及不同濃度H2O2(100、200、400 μmol/L)處理組細(xì)胞，Trizol法提取組織和細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)體系：Master Mix 10 μl，正反向引物各2 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 10 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性25 s，60 ℃退火40 s，60 ℃延伸50 s，重復(fù)45個循環(huán)。行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA<0.5 μl，正向引物(10 μmol/L)1.0～2.0 μl，反向引物(10 μmol/L)1.0～2.0 μl，10倍Easy Taq buffer 5.0 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μl，Easy Taq DNA聚合酶0.5 μl，ddH2O定容至50.0 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。瓊脂糖凝膠電泳，用圖像記錄分析系統(tǒng)對目的基因、參比基因的條帶灰度值進(jìn)行分析。目的基因表達(dá)量=目標(biāo)DNA條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值×100%。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在含200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以上述方法檢測細(xì)胞內(nèi)miR-125b的相對表達(dá)量。每個實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次。引物序列：miR-125b正向引物為5’-CGTATCGGATTCGGACTTGC-3’，反向引物為5’-CTTTAGCTAGGGCTAGCGTG-3’；GAPDH正向引物為5’-AGTGCTAGCTGATATGAC-3’，反向引物為5’-CGTAGTCGATGCATAGCT-3’。

1.2.6Western blot法測定晶狀體前囊膜組織標(biāo)本和HLEB-3細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá) 采用不同濃度H2O2(0、100、200和400 μmol/L H2O2)分別處理細(xì)胞24 h，收集各組細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，將蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠加樣孔進(jìn)行電泳，使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST溫和洗膜3 min后加入相應(yīng)的一抗(1∶ 100)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌10 min，共3次，加入對應(yīng)二抗(1∶ 1 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌10 min，共3次，加入配制好的ECL發(fā)光液，避光孵育5 min，采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀采集圖片信息，圖片用Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白和內(nèi)參灰度之比，即為蛋白相對表達(dá)量。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以上述方法檢測細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)。每個實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7免疫熒光雙染色法檢測細(xì)胞內(nèi)Keap1、Nrf2表達(dá) 采用200 μmol/L H2O2處理細(xì)胞24 h，PBS洗滌細(xì)胞，采用預(yù)冷多聚甲醛在4 ℃下固定30 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫處理10 min，室溫下PBS洗滌5 min，封閉液中室溫封閉30 min，加入鼠源Keap1(1∶ 20)、兔源Nrf2(1∶ 100)一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌細(xì)胞，加入相應(yīng)二抗(1∶ 1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗滌，加入核染色劑室溫染色1 min，PBS洗滌后，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)Keap1和Nrf2熒光強(qiáng)度，每個切片任意選取5個視野。ROS陽性反應(yīng)呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

1.2.8靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報告基因分析 為了確定miR-125b在HLEB-3細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能的靶向作用點(diǎn)，利用miRanda、TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-125b的潛在靶基因，其中Nrf2在miR-125b的3’UTR上有結(jié)合位點(diǎn)。將處于對數(shù)生長期的HLEB-3細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于24孔板，用LipofectamineTM2000將熒光素酶報告載體(Nrf2-3’-UTR-WT或Nrf2-3’UTR-MT)與miR-125b擬似物/抑制物/對照共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以Renilla熒光素酶質(zhì)粒(100 ng/孔)為對照，與載體共轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，以GAPDH為內(nèi)參，用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(美國IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料的數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示，組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊。采用均衡分組單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計(jì)，正常供體晶狀體前囊膜和白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組間各檢測指標(biāo)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，miR-125b擬似物組、miR-125b對照組和miR-125b抑制物組間各檢測指標(biāo)總體差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常供體和白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織中miR-125b和Nrf2表達(dá)

白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中miR-125b和Nrf2蛋白的表達(dá)條帶均明顯增強(qiáng)。白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中miR-125b和Nrf2蛋白的相對表達(dá)量分別為0.89±0.05和0.84±0.12,明顯高于正常供體中的0.21±0.03和0.27±0.06,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.355，P<0.05;t=18.647，P<0.05)(圖1)。

圖1 正常供體和白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中miR-125b和Nrf2蛋白的表達(dá) A：逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測各組晶狀體前囊膜中miR-125b的表達(dá) B：Western blot法檢測各組晶狀體前囊膜中Nrf2蛋白的表達(dá) C：各組晶狀體組織中miR-125b的相對表達(dá)量比較 與正常晶狀體組織比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；白內(nèi)障組織,n=24;正常組織,n=20) D：各組晶狀體組織中Nrf2蛋白的相對表達(dá)量比較 與正常晶狀體組織比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；白內(nèi)障組織,n=24;正常組織,n=20) 1:白內(nèi)障晶狀體組織 2:正常晶狀體組織 miR：微小RNA；GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2Figure 1 Expression levels of miR-125b and Nrf2 protein in the lens anterior capsule of normal donors and cataract patients A：The expression intensity of miR-125b in the lens anterior capsule of different specimens by reverse transcription PCR B：The expression intensity of Nrf2 protein in the lens anterior capsule of different specimens by Western blot assay C：The comparison of relative expression levels of miR-125b Compared with the normal anterior lens capsule specimen，aP<0.05 (Independent-samples t test;cataract tissues,n=24;normal tissues,n=20) D：The comparison of relative expression levels of Nrf2 protein Compared with the normal anterior lens capsule specimen，aP<0.05 (Independent-samples t test；cataract tissues,n=24;normal tissues,n=20) 1:Lens anterior capsule of cataract patients 2:Lens anterior capsule of normal donors miR：microRNA；GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;Nrf2：nuclear factor E2-related factor 2

2.2 不同濃度H2O2處理組細(xì)胞中miR-125b、Nrf2的表達(dá)比較

與對照組比較，100、200和400 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)miR-125b和Nrf2蛋白表達(dá)條帶均明顯增強(qiáng)，且隨著H2O2濃度增加，miR-125b和Nrf2蛋白的表達(dá)條帶均逐漸增強(qiáng)。對照組及100、200和400 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)miR-125b相對表達(dá)量分別為0.21±0.03、0.52±0.05、0.69±0.04和0.86±0.11，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.513，P<0.01)，100、200和400 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)miR-125b相對表達(dá)量均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。對照組及100、200和400 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白相對表達(dá)量分別為0.24±0.04、0.49±0.06、0.74±0.06和0.91±0.10，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.228，P=0.012)，100、200和400 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白相對表達(dá)量均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖2)。

圖2 不同濃度H2O2處理組細(xì)胞中miR-125b和Nrf2的表達(dá) A：逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測各組細(xì)胞中miR-125b表達(dá) B：各組細(xì)胞中miR-125b相對表達(dá)量比較 F=13.513，P<0.01.與對照組比較，aP<0.05；與100 μmol/L H2O2組比較，bP<0.05；與200 μmol/L H2O2組比較，cP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=6) C：Western blot法檢測不同濃度H2O2處理組細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá) D：各組細(xì)胞中Nrf2蛋白相對表達(dá)量比較 F=10.228，P=0.012.與對照組比較，aP<0.05；與100 μmol/L H2O2組比較，bP<0.05；與200 μmol/L H2O2組比較，cP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=6) 1:對照組 2:100 μmol/L H2O2組 3:200 μmol/L H2O2組 4:400 μmol/L H2O2組 miR：微小RNA；GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2Figure 2 Expression levels of miR-125b and Nrf2 protein in different concentrations of H2O2groups A：The expression intensity of miR-125b in different concentrations of H2O2 groups by reverse transcription PCR B：Comparison of relative expression levels of miR-125b among different concentrations of H2O2 groups F=13.513，P<0.01.Compared with the control group，aP<0.05；compared with the 100 μmol/L H2O2 group，bP<0.05；compared with the 200 μmol/L H2O2 group，cP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=6) C：The expression intensity of Nrf2 protein in oxidative stress model groups by Western blot D：Comparison of relative expression levels of Nrf2 protein F=10.228，P=0.012.Compared with the control group，aP<0.05；compared with the 100 μmol/L H2O2 group，bP<0.05；compared with the 200 μmol/L H2O2 group，cP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=6) 1:Control group 2:100 μmol/L H2O2 group 3:200 μmol/L H2O2 group 4:400 μmol/L H2O2 group miR：micro RNA；GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；Nrf2：nuclear factor E2-related factor 2

圖3 不同濃度H2O2處理組細(xì)胞內(nèi)源性ROS表達(dá)(×600，標(biāo)尺=100 μm) ROS陽性反應(yīng)呈綠色熒光(DCFH-DA)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI)。隨著H2O2濃度的增加，ROS熒光明顯增強(qiáng) ROS：活性氧簇；H2O2：過氧化氫Figure 3 The expression intensity of endogenous ROS in different concentrations of H2O2 groups(×600，bar=100 μm) ROS-positive reaction showed green fluorescence (DCFH-DA)，and nuclei showed blue fluorescence (DAPI).The ROS response was enhanced with the increase of H2O2 concentration ROS：reactive oxygen species；H2O2：hydrogen peroxide

2.3 不同濃度H2O2處理組細(xì)胞中ROS含量及氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性比較

對照組未發(fā)現(xiàn)ROS熒光，隨著處理組H2O2濃度增加，ROS熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(圖3)。對照組及100、200和400 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)源性ROS熒光強(qiáng)度分別為89.43±3.23、147.38±8.33、94.44±7.29和252.34±11.31，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.316，P<0.01)，100、200和400 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)源性ROS熒光強(qiáng)度均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與對照組比較，各組T-AOC、GSH-Px和SOD活性均明顯降低，MDA濃度明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，這種差異隨著H2O2濃度的增加而增大,任意2個組間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

圖4 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中內(nèi)源性ROS熒光表達(dá)(×600，標(biāo)尺=100 μm) 細(xì)胞中ROS反應(yīng)呈綠色熒光(DCFH-DA)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI)。不同轉(zhuǎn)染組中miR-125b擬似物組細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度最弱，miR-125b抑制物組ROS熒光最強(qiáng) ROS：活性氧簇；miR：微小RNAFigure 4 The response intensity of endogenous ROS in different transfected groups(×600，bar=100 μm) The positive response of ROS showed green fluorescence (DCFH-DA)，and the nuclei displayed blue fluorescence (DAPI).In different transfected groups，ROS response was the weakest in the miR-125b mimics group and strongest in the miR-125b inhibitor group ROS：reactive oxygen species；miR：micro RNA

表1 不同濃度H2O2處理組細(xì)胞中T-AOC、SOD、GSH-Px活性和MDA濃度比較(mean±SD)Table 1 Comparison of T-AOC,SOD,GSH-Px activities and MDA concentration among different concentrations of H2O2groups(mean±SD)組別樣本量T-AOC活性[mol/(min·L)]SOD活性[mol/(min·L)]GSH-Px活性[mol/(min·L)]MDA濃度(μmol/L)對照組67.85±0.4684.58±3.99160.62±8.6835.73±1.38100μmol/L H2O2組65.63±0.49a69.01±3.56a130.25±3.43a45.02±2.26a200μmol/L H2O2組63.87±0.55ab56.40±2.43ab103.25±4.38ab57.84±3.87ab400μmol/L H2O2組61.29±0.17abc25.12±3.54abc62.63±3.48abc71.25±2.43abcF值27.94531.25735.12420.547P值<0.01<0.01<0.01<0.01 注:與各自的對照組比較,aP<0.05;與各自的100μmol/L H2O2組比較,bP<0.05;與各自的200μmol/L H2O2組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) H2O2:過氧化氫;T-AOC:總抗氧化能力;SOD:超氧化物歧化酶;GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶;MDA:丙二醛 Note:Compared with the respective control group,aP<0.05;compared with the re-spective 100μmol/L H2O2 group,bP<0.05;compared with the respective 200μmol/L H2O2 group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) H2O2:hydrogen peroxide;T-AOC:total-antioxidative capability;SOD:superoxide dismutase;GSH-Px:glutathi-one peroxidase;MDA:malondialdehyde

2.4 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)表達(dá)

miR-125b擬似物組ROS表達(dá)最弱，miR-125b抑制物組ROS表達(dá)最強(qiáng)(圖4)。miR-125b擬似物組、miR-125b對照組和miR-125b抑制物組細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度分別為73.23±5.33、189.32±7.33和324.23±10.33，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.138，P<0.01)，miR-125b擬似物組ROS熒光強(qiáng)度顯著低于miR-125b對照組和miR-125b抑制物組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；miR-125b擬似物組細(xì)胞內(nèi)T-AOC、SOD和GSH-Px活性均顯著高于miR-125b對照組，MDA濃度低于miR-125b對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與miR-125b對照組比較，miR-125b抑制物組細(xì)胞內(nèi)T-AOC、SOD和GSH-Px活性均明顯下降，MDA濃度明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

表2 不同轉(zhuǎn)染組LECs中T-AOC、SOD、GSH-Px活性和MDA濃度比較(mean±SD)Table 2 Comparison of T-AOC,SOD and GSH-Px activities and MDA concentration among different transfected groups (mean±SD)組別樣本量T-AOC活性[μmol/(min·L)]SOD活性[μmol/(min·L)]GSH-Px活性[μmol/(min·L)]MDA濃度[(μmol/L)]miR-125b擬似物組66.31±0.4668.93±4.27126.39±8.9037.87±1.49miR-125b對照組63.50±0.55a54.42±2.41a104.95±6.63a56.92±3.89amiR-125b抑制物組62.62±0.36ab34.28±3.06ab73.83±3.70ab72.59±3.42bF值13.95316.3379.12418.783P值<0.01<0.01<0.01<0.01 注:與各自的miR-125b擬似物組比較,aP<0.05;與各自的miR-125b對照組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) LECs:晶狀體上皮細(xì)胞;T-AOC:總抗氧化能力;SOD:超氧化物歧化酶;GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶;MDA:丙二醛;miR:微小RNA Note:Compared with respective miR-125b mimics group,aP<0.05;compared with respective miR-125b control group,bP<0.05 (One-way ANO-VA,LSD-t test) LECs:lens epithelial cells;T-AOC:total-antioxidative capability;SOD:superoxide dismutase;GSH-Px:glutathione peroxidase;MDA:malondialdehyde;miR:micro RNA

2.5 miR-125b靶基因預(yù)測

miR-125b靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-125b與Nrf2保守位點(diǎn)有高分?jǐn)?shù)結(jié)合，Nrf2為miR125b的一個潛在作用靶點(diǎn)。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-125b擬似物刺激HELE3細(xì)胞中Nrf2-3’-UTR-WT報告基因的熒光素酶活性，而miR-125b抑制物抑制Nrf2-3’-UTR-WT報告基因的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)染突變載體的細(xì)胞內(nèi)未觀察到明顯的熒光素酶活性改變，提示Nrf2是miR-125b的直接靶向蛋白。miR-125b擬似物組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白相對表達(dá)量高于miR-125b對照組，miR-125b抑制物組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白相對表達(dá)量低于miR-125b對照組和miR-125b擬似物組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表3，圖5)。200 μmol/L H2O2刺激后，Nrf2表達(dá)發(fā)生核轉(zhuǎn)移，miR-125b擬似物組細(xì)胞質(zhì)中Nrf2熒光染色最強(qiáng)，核轉(zhuǎn)移也最顯著，細(xì)胞質(zhì)中Keap1的表達(dá)微弱；miR-125b抑制物組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2熒光較弱，核轉(zhuǎn)移程度最弱，細(xì)胞質(zhì)中Keap1的熒光最強(qiáng)(圖6)。

表3 不同轉(zhuǎn)染組miR-125b靶基因預(yù)測相關(guān)指標(biāo)比較(mean±SD)Table 3 Comparison of miR-125b target gene prediction indicators among different transfected groups (mean±SD)組別樣本量Nrf2-3’-UTR-WT報告基因的熒光素酶活性Nrf2-3’-UTR-MT報告基因的熒光素酶活性Nrf2相對蛋白表達(dá)水平miR-125b擬似物組61.77±0.151.41±0.070.97±0.01miR-125b對照組60.97±0.11a1.38±0.090.78±0.06amiR-125b抑制物組60.52±0.06ab1.46±0.090.43±0.03abF值11.3140.12418.413P值0.0111.310<0.01 注:與各自的miR-125b擬似物組比較,aP<0.05;與各自的miR-125b對照組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) miR:微小RNA;Nrf2:核因子E2相關(guān)因子2;UTR:非翻譯區(qū);WT:野生型;MT:突變型 Note:Compared with the respective miR-125b mimics group,aP<0.05;compared with the respective miR-125b control group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miR:micro RNA;Nrf2:nuclear factor E2-related factor 2;UTR:untranslated region;WT:wild type;MT:mutant type

圖5 miR-125b靶基因預(yù)測結(jié)果 A：生物信息軟件檢測Nrf2和miR-125b潛在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測Nrf2和miR-125b的直接關(guān)系 B：Western blot法檢測不同轉(zhuǎn)染組Nrf2蛋白表達(dá) miR-125b抑制物組細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)條帶弱于miR-125b對照組和miR-125b擬似物組 miR：微小RNA；Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2;UTR：非翻譯區(qū)；WT：野生型；MT：突變型；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 5 MiR-125b target gene prediction A：Bioinformatics software detected the binding sites of Nrf2 and miR-125b，and the double luciferase reporter gene assay showed a direct relationship between Nrf2 and miR-125b B：The expression intensity of Nrf2 protein in different transfected groups by Western blot assay The intensity of Nrf2 band was weakened in the miR-125b inhibitor group compared with the miR-125b control group and miR-125b mimics group miR：microRNA；Nrf2：nuclear factor E2-related factor 2;UTR:untranslated region;WT:wild type;MT:mutant type;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

3 討論

氧化應(yīng)激損傷指機(jī)體內(nèi)源性或外源性ROS對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的綜合損傷，或?qū)?xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)及其他重要因子的損傷[2-3,9]。研究發(fā)現(xiàn)，多種刺激因子產(chǎn)生的氧自由基介導(dǎo)的氧化損傷是導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展的重要原因，白內(nèi)障患者房水中H2O2濃度升高，介導(dǎo)早期氧化應(yīng)激[10-11]。本研究用不同濃度的H2O2刺激HLEB-3細(xì)胞，成功建立氧化應(yīng)激模型。近年來，miRNA在白內(nèi)障中的作用越來越受到關(guān)注。miR-125b是近年來廣泛研究的miRNA之一，與多種細(xì)胞的生物學(xué)活動密切相關(guān)，如多種癌細(xì)胞、成骨細(xì)胞等[12-15]。Li等[16]研究證實(shí)，miR-125b通過靶向p53誘導(dǎo)的核蛋白1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移；Wu等[17]研究證實(shí)miR-125b通過靶向胃癌中的PPP1CA-Rb信號通路來促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，導(dǎo)致預(yù)后不良；彭俊等[18]報道m(xù)iR-125b可調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力；也有研究報道m(xù)iR-125b通過靶向Stat3調(diào)節(jié)單核細(xì)胞中降鈣素的生成[19]，但其對白內(nèi)障晶狀體細(xì)胞生物學(xué)行為是否有調(diào)控作用尚未見報道。本研究檢測miR-125b在白內(nèi)障晶狀體前囊膜組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-125b在發(fā)生白內(nèi)障的晶狀體前囊膜組織內(nèi)的表達(dá)增加，經(jīng)過H2O2刺激的HLEB-3細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)隨著H2O2濃度的升高而增加，提示miR-125b可能參與了白內(nèi)障的發(fā)病過程。

圖6 免疫熒光雙染色檢測不同轉(zhuǎn)染組LECs中Keap1、Nrf2的表達(dá)和定位(×600，標(biāo)尺=100 μm) 免疫熒光雙染色顯示細(xì)胞質(zhì)中Keap1反應(yīng)呈綠色熒光，Nrf2反應(yīng)呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI) miR-125b擬似物組細(xì)胞質(zhì)中Keap1熒光強(qiáng)度弱，Nrf2熒光強(qiáng)，存在大量核轉(zhuǎn)移；miR-125b對照組細(xì)胞質(zhì)中Keap1熒光稍強(qiáng)于miR-125b擬似物組，Nrf2熒光強(qiáng)度弱，存在少量核轉(zhuǎn)移；miR-125b抑制物組Keap1熒光強(qiáng)，Nrf2熒光微弱 Keap1：Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1；Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；miR：微小RNAFigure 6 Expression and localization of Keap1 and Nrf2 in lens epithelial cells in different transfected groups by immunofluorescence double staining (×600，bar=100 μm) The Keap1 presented green fluorescence and Nrf2 showed red fluorescence，and the nuclei displayed blue fluorescence.The fluorescence of Keap1 in the cytoplasm was weaker and Nrf2 was stronger in the miR-125b mimics group，indicating more nuclear metastases.In the miR-125b control group，the Keap1 fluorescence was slightly enhanced and Nrf2 was weakened in comparison with the miR-125b mimics group.Keap1 fluorescence was strong and Nrf2 was weakened in the miR-125b inhibitor group Keap1：kelch-like ECH-associated protein-1；Nrf2：nuclear factor E2-related factor 2；miR：micro RNA

生理狀態(tài)下適量的ROS自由基對維持機(jī)體氧化平衡狀態(tài)有重要意義，氧化應(yīng)激條件下促氧化劑與抗氧化劑之間失衡，誘導(dǎo)LECs的線粒體損傷，ROS水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量MDA，SOD、T-AOC、GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶，其活性降低會直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基積累[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激模型細(xì)胞內(nèi)ROS活性、MDA濃度均高于對照組，而SOD、T-AOC、GSH-Px的活性均顯著下降，與預(yù)測結(jié)果一致。miR-125b在多種細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Wei等[7]報道m(xù)iR-125b-5p在氧化應(yīng)激下能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于凋亡；Liu等[8]研究證實(shí)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)可刺激miR-125b的表達(dá)，從而緩解葡萄糖代謝異常。本研究中發(fā)現(xiàn)，在200 μmol/L H2O2的刺激下轉(zhuǎn)染miR-125b擬似物組的細(xì)胞中SOD、T-AOC、GSH-Px活性較miR-125b對照組增加，ROS活性和MDA濃度降低，轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物組細(xì)胞中SOD、T-AOC、GSH-Px活性下調(diào)，ROS活性和MDA濃度均較高，說明miR-125b可能是通過緩解LECs的氧化應(yīng)激損傷而參與白內(nèi)障的發(fā)病過程。

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下Nrf2與Keap1以復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，Nrf2處于非活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷信號刺激時，Nrf2被激活進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動下游HO-1的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，該信號通路在細(xì)胞的氧化應(yīng)激、抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用[22-24]。李佳等[25]研究證實(shí)，Nrf2在人LECs中的高表達(dá)及核移位能增加抗氧化酶的含量，從而起到自身抗氧化損傷作用。為了進(jìn)一步研究miR-125b調(diào)控LECs氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制，本研究用miRanda、TargetScan數(shù)據(jù)庫篩選miR-125b下游靶向蛋白，發(fā)現(xiàn)miR-125b與Nrf2保守位點(diǎn)有高分?jǐn)?shù)結(jié)合，Nrf2為miR-125b的一個潛在作用靶點(diǎn)。同時，在miR-125b擬似物組細(xì)胞內(nèi)，Nrf2的表達(dá)高于miR-125b對照組，而Nrf2在miR-125b抑制物組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)受到抑制。免疫熒光雙染色檢測發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)染時間的增加，miR-125b擬似組細(xì)胞內(nèi)Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，細(xì)胞質(zhì)中Keap1的表達(dá)也隨之減弱，而Nrf2核轉(zhuǎn)移相對較弱的miR-125b抑制物組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Keap1的表達(dá)較強(qiáng)烈。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-125b能緩解年齡相關(guān)性白內(nèi)障LECs氧化應(yīng)激損傷，這種作用可能是通過靶向刺激Nrf2的表達(dá)、調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路的活性而實(shí)現(xiàn)的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突