劉夢(mèng)倩　蘇麗環(huán)　楊寶貞　閆洪波

摘 ? ?要：以普通小麥為材料，探討保護(hù)液中不同DMSO濃度、蔗糖濃度及不同冷凍處理時(shí)間對(duì)超低溫保存后小麥莖尖成活率的影響，以獲得最優(yōu)超低溫保存方法。重點(diǎn)針對(duì)小麥在超低溫保存時(shí)的各處理?xiàng)l件對(duì)小麥莖尖成活率的影響展開了試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)保護(hù)液中含16%濃度的DMSO和6%濃度的蔗糖，并將預(yù)處理后的小麥莖尖采用梯度降溫法：0 ℃停留存放30 min、-7 ℃停留存放1 h、-20 ℃停留存放1 h、迅速轉(zhuǎn)移放入-80 ℃冰箱停留存放1 h、迅速投入液氮中過夜的超低溫保存條件達(dá)到最高成活率，從而確定了小麥莖尖超低溫處理時(shí)保護(hù)液中的最佳濃度組合及低溫處理的最佳時(shí)間。

關(guān)鍵詞：小麥莖尖;超低溫保存;處理?xiàng)l件;優(yōu)化

文章編號(hào)： 1005-2690（2021）05-0011-02 ? ? ? 中國(guó)圖書分類號(hào)： S512.1 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

在現(xiàn)代社會(huì)中，隨著人口不斷增長(zhǎng)，對(duì)糧食的需求也隨之增大，小麥作為重要谷物來源之一，急需增加其年產(chǎn)量。但是近年來，隨著小麥種植面積減少，如何利用有限的土地資源提升單位面積小麥的年產(chǎn)量，成為育種家所要面臨的巨大難題。為了利用最完整的科學(xué)方法改進(jìn)其生產(chǎn)特性，研究者投入了大量的精力和資金。除了傳統(tǒng)的遺傳方法外，生物技術(shù)方法也被廣泛應(yīng)用于新型小麥培育。

由于復(fù)雜和昂貴的生物技術(shù)而產(chǎn)生的細(xì)胞系體外保存是一個(gè)實(shí)際問題。然而，種質(zhì)的長(zhǎng)期培養(yǎng)需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行周期性的再培養(yǎng)，有可能由于感染、形態(tài)發(fā)生潛力的降低和體細(xì)胞無(wú)性系變異的出現(xiàn)導(dǎo)致標(biāo)本丟失。

長(zhǎng)期保存的植物材料集合在液氮溫度（-196 ℃）允許損失價(jià)值的標(biāo)本要避免和減少費(fèi)用，因此，開發(fā)高效可靠的低溫保存方法是目前最迫切的問題。

植物冷硬化[1]和糖溶液中的孵化[2]用于提高植物的耐寒性。此外，這些程序也被包括在低溫保存方案中，以增加收集標(biāo)本在液氮中冷凍前的冷凍抵抗能力。另外，植物材料的冷硬化還涉及在預(yù)培養(yǎng)階段的處理，使用脫落酸（ABA）和非穿透性或穿透性低溫保護(hù)劑，如二甲亞砜（DMSO）、乙二醇、甘油及其組合[3]。而一些低溫保護(hù)劑，如DMSO，是有毒的，并顯示誘變特性。即使經(jīng)過冷硬化和蔗糖處理，體外培養(yǎng)的植物細(xì)胞、組織和器官也含有許多游離的未結(jié)合水分子。因此，有必要對(duì)冷凍前的標(biāo)本進(jìn)行脫水處理，也就是說，自由細(xì)胞游離水能夠形成冰晶凍結(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[4]。

植物材料的脫水有多種程序，可通過在可編程設(shè)備中緩慢冷凍過程中生長(zhǎng)細(xì)胞外冰晶來脫水、玻璃化溶液中的脫水，以及無(wú)菌空氣流或吸濕物質(zhì)或其飽和溶液中的部分干燥。

小麥的超低溫保存研究主要集中在將小麥種子投入液氮中進(jìn)行超低溫保存，以及幼苗生長(zhǎng)、耐低溫能力及抗老化能力的影響等方面。但是對(duì)于小麥莖尖的超低溫保存研究報(bào)道較少，本試驗(yàn)嘗試用超低溫保存剛萌發(fā)出的小麥莖尖，找到用液氮超低溫保存小麥幼苗的路線。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

試驗(yàn)所用小麥種子由河北省農(nóng)林科學(xué)院提供。

1.2 ? 種子消毒與培養(yǎng)方法

挑選大小均一、飽滿整齊的小麥種子，用流動(dòng)的自來水沖洗15 min;清洗后的種子用濃度為0.1%的升汞浸泡15 min，然后用無(wú)菌水浸泡洗滌3次，每次1 min;接著用濃度為75%的乙醇浸泡洗滌1 min，再用無(wú)菌水浸泡洗滌3 次，每次1 min;最終把種子轉(zhuǎn)移到帶有少許無(wú)菌水的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中大約放入 50粒種子。待小麥發(fā)芽第2天，切去小麥根部組織，留下莖尖部位。

1.3 ? 小麥莖尖超低溫處理流程

把小麥莖尖放入無(wú)菌的1.5 mL離心管中，加入由蔗糖和DMSO組成的冷凍保護(hù)劑，高濃度的蔗糖及DMSO對(duì)細(xì)胞具有毒性，而低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)能力又不足，因此設(shè)置了5個(gè)DMSO濃度梯度來研究DMSO的保護(hù)效果，分別為6%、12%、16%、20%、24%，同時(shí)在控制DMSO某個(gè)濃度不變的情況下，設(shè)置了5個(gè)蔗糖濃度梯度來研究蔗糖濃度的保護(hù)效果，分別為0、3%、6%、9%、12%。然后進(jìn)行梯度降溫處理， 4 ℃ 3 h、0 ℃一段時(shí)間、-7 ℃ 1 h、-20 ℃ 1 h、 -80 ℃ 1 h，然后放入液氮中過夜。為研究0 ℃處理時(shí)間對(duì)超低溫保存后成活率影響，設(shè)置了 0 min、15 min、30 min、45 min、60 min 這5個(gè)梯度。從液氮中取出材料，在40 ℃條件下快速解凍。

1.4 ? 成活率的測(cè)定與統(tǒng)計(jì)方法

將解凍后的小麥莖尖中的保護(hù)劑吸出，并在無(wú)菌水中清洗兩次，每次30 s，接著將小麥莖尖放到經(jīng)過高壓滅菌的濾紙上吸去殘液，接種到不加激素的MS培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)到正常光照條件下培養(yǎng)，15～20 d后統(tǒng)計(jì)莖尖成活個(gè)數(shù)（以出現(xiàn)綠色莖尖為成活標(biāo)志）。根據(jù)成活個(gè)數(shù)與處理總數(shù)的比例來確定成活率[5]。上述試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣品，最終取其平均值。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 保護(hù)液中不同DMSO濃度對(duì)成活率的影響

DMSO是超低溫保存植物材料的常用保護(hù)劑之一。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，16% DMSO處理的小麥莖尖成活率最高，約為60.15%。由此可以得知，高濃度的DMSO對(duì)小麥莖尖的毒害作用很大，但是過低濃度的DMSO對(duì)小麥莖尖的保護(hù)作用又不明顯，16%濃度的DMSO可以作為小麥莖尖的超低溫冷凍保護(hù)劑濃度使用量。

2.2 ? 預(yù)處理液中不同蔗糖濃度對(duì)成活率的影響

如圖 1 所示，保護(hù)劑中沒有蔗糖的成活率較低，僅為10.73%;蔗糖濃度在6%之前，莖尖成活率與濃度成正相關(guān);蔗糖濃度在6%時(shí)，成活率達(dá)到最高值。蔗糖濃度在6%以上時(shí)，隨著蔗糖濃度的升高，小麥莖尖成活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì);當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到12%時(shí)，成活率降為32.62%，這是由于過高的蔗糖濃度形成的高滲透壓可能對(duì)小麥莖尖造成傷害，導(dǎo)致小麥莖尖受到損傷，影響其成活率。

2.3 ? 不同處理時(shí)間對(duì)小麥莖尖成活率的影響

在逐步降溫的過程中，可以充分提取細(xì)胞內(nèi)的水分，從而有效避免植物材料冷凍保存過程中形成細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，達(dá)到良好的保存效果。據(jù)了解，滯留可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的溶液凍結(jié)，使細(xì)胞外產(chǎn)生蒸汽壓差，并進(jìn)行保護(hù)性脫水，否則，細(xì)胞外可能產(chǎn)生異質(zhì)性冰晶，對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害。如表2所示，將預(yù)冷處理的小麥莖尖0 ℃處理0 min、15 min、30 min、45 min、1 h，解凍后發(fā)現(xiàn)0 ℃處理30 min小麥莖尖的成活率最高。

綜上所述，小麥莖尖保護(hù)劑中不同 DMSO 濃度、蔗糖濃度及低溫處理時(shí)間都對(duì)小麥莖尖的超低溫保存成活率有著顯著影響。當(dāng)保護(hù)劑中DMSO濃度為16%、蔗糖濃度為6%，并且在0 ℃處理30 min后，再經(jīng)后續(xù)處理，最終接種到 MS培養(yǎng)基上，可使小麥莖尖在第15天達(dá)到最高成活率59.36%。

有研究表明，曾琳等[6]對(duì)降香黃檀種子進(jìn)行超低溫保存，得到解凍后種子的成活率為50.45%。王君暉等[7]用二步法對(duì)大麥幼穗進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，解凍后的幼穗成活率達(dá)50%左右。孫龍華等[8]研究紅豆草組織物的超低溫處理，用此方法得到解凍后的組織成活率達(dá)66%。扁桃莖尖在4 ℃環(huán)境下隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其存活率不斷提高，但低溫處理時(shí)間超過28 d后，其存活率便不斷降低;而未經(jīng)過低溫處理的扁桃莖尖進(jìn)行超低溫保存后的存活率為0。雖然后期生長(zhǎng)需重新生根，但小麥莖尖的超低溫保存也可成為一種種質(zhì)保存途徑。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] Salcheva，G.，Samygin，G.A..Microscopic observations of freezing of winter wheat tissues[J].Fiziol. Rast，1963（1）：65-72.

[ 2 ] Tumanov，I.I.，Krasavtsev，O.A.，Trunova，T.I..Survival of winter wheat at 196 ℃ as a result of vitrification[J].Dokl. Akad.Nauk SSSR，1965：978-981.

[ 3 ] Popov，A.S..Some mechanisms of plant cell cryodamage in vitro and characteristic of their cryopreservation[J].Fiziol. Rast.，1993（3）：485-496.

[ 4 ] Samygin，G.A..Prichiny vymerzaniya rastenii （Causes of Plant Winterkilling）[M].Moscow：Nauka，1974.

[ 5 ] 盧杰.微藻、草莓和小麥的超低溫保存條件的建立與DNA直接轉(zhuǎn)化探究[D].石家莊：河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)，2020.

[ 6 ] 曾琳，何明軍，陳葵，等.降香黃檀種子和離體胚超低溫保存研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（12）：2263-2266.

[ 7 ] 王君暉，嚴(yán)慶豐，黃純農(nóng).大麥幼穗的玻璃化法超低溫保存及凍后植株再生[J].植物學(xué)報(bào)，1996（9）：730-734.

[ 8 ] 孫龍華，簡(jiǎn)令成.紅豆草組織培養(yǎng)物的超低溫保存及其超微結(jié)構(gòu)的觀察[J].Journal of Integrative Plant Biology，1990（4）：262-267，333-335.