幸世峰，孫理華，駱小梅

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是影響人群健康的重大疾病。新疆是AS高發(fā)區(qū)域，故該地區(qū)的AS防控面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)［1］。研究表明，AS是一種免疫介導(dǎo)的動脈管壁慢性炎癥，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜［2］。血管壁炎癥激活被認(rèn)為是AS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，其中巨噬細(xì)胞扮演著關(guān)鍵角色：一方面巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞是AS斑塊脂質(zhì)條紋期的標(biāo)志；另一方面，巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞在各種促炎因子的刺激下，可分泌大量促炎因子、趨化因子及其他因子，進(jìn)一步加劇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集、脂質(zhì)蓄積和基質(zhì)降解［3］。因此，抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積（泡沫化）和炎癥因子釋放是防治AS的重要途徑［4］。

巨噬細(xì)胞膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)失衡是泡沫細(xì)胞形成過程中的主要特征。膽固醇流出對減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積、抑制泡沫細(xì)胞形成和防治AS發(fā)生具有重要意義［5］。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）等膜蛋白是以三磷酸腺苷（ATP）為能源，將細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，能有效減少細(xì)胞內(nèi)的膽固醇蓄積。而ABCA1又受多種因子調(diào)節(jié)，其中核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號通路是其最重要的調(diào)節(jié)途徑。在AS部位和纖維斑塊部位均發(fā)現(xiàn)了激活的 NF-κB，而正常血管很少或沒有表達(dá)NF-κB，證實(shí)NF-κB在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，AS越嚴(yán)重，則微小RNA（miR）-146a表達(dá)水平越高，說明miR-146a表達(dá)調(diào)控與AS發(fā)生存在因果關(guān)系［6］。miR-146a是miR-146家族一員，是先天性和適應(yīng)性免疫中細(xì)胞分化和細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)劑，其受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后可通過抑制NF-κB依賴性的兩種銜接蛋白——IL-1受體相關(guān)激酶1（IL-1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1）和TNF受體相關(guān)因子 6（TNF receptor related factor 6，TRAF6）而在巨噬細(xì)胞中起到炎癥制動作用［7］。但泡沫細(xì)胞miR-146a表達(dá)上調(diào)是否對ABCA1表達(dá)有抑制作用及是否導(dǎo)致膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)減少而參與AS形成的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。本研究擬通過使用miR-146a mimics及miR-146a inhibits轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，觀察miR-146a對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出和ABCA1表達(dá)的影響，以探討miR-146a在AS發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，以期為AS的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型建立 本次實(shí)驗(yàn)時間為2018年12月—2020年6月。將THP-1細(xì)胞（人單核細(xì)胞株）放置在含10 mmol/L HEPES、10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞到達(dá)對數(shù)生長期時（培養(yǎng)24～36 h），采用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/孔并接種于6孔板中，加入含終濃度為100 ng/ml的佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 ml。培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞貼壁、形態(tài)變化并拍照。THP-1細(xì)胞呈單個圓形懸浮，密度約為5×106/ml，分布均勻，折光度較好。經(jīng)PMA誘導(dǎo)后單個圓形、懸浮細(xì)胞逐漸形成梭形或不規(guī)則形狀，并有偽足形成的貼壁細(xì)胞，即分化為巨噬細(xì)胞（見圖1）。再采用含50 μg/ml氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，使其吞噬脂質(zhì)形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。

圖1 PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化前后Figure 1 Before and after differentiation of THP-1 cells induced by PMA

1.2 膽固醇流出檢測方法 將巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞分為空白對照組，培養(yǎng)液中不加任何其他試劑；陽性對照組，培養(yǎng)液中加入10 μmol/L肝X受體激動劑T0901317；陰性對照組，培養(yǎng)液中加入100 nmol/L ABCA1小干擾RNA（siRNA）；模擬物組，培養(yǎng)液中加入40 nmol/L miR-146a mimics；抑制劑組，培養(yǎng)液中加入40 nmol/L miR-146a inhibits。采用液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測膽固醇流出效率：THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞后，加入3H標(biāo)記的膽固醇（0.5 μCi/ml）共同孵育、標(biāo)記24 h，后采用RPMI 1640培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h。采用液體閃爍液裂解細(xì)胞，收集培養(yǎng)液和裂解的細(xì)胞中3H標(biāo)記的膽固醇含量，并以每分鐘流出計(jì)數(shù)（counts per minute，CPM）表示。膽固醇流出效率=細(xì)胞內(nèi)CPM/（細(xì)胞內(nèi)CPM+培養(yǎng)液中CPM）×100%。

1.3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù) 將巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞以1×106的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，匯合度達(dá)到80%后分別轉(zhuǎn)染miR-146a mimics（模擬物組）、miR-146a inhibits（抑制劑組）及In-NC（NC組）。48～72 h 后采用胰酶消化收集細(xì)胞，固定，采用Annexin V-APC和7-AAD（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）雙染細(xì)胞。37 ℃溫浴30 min后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，離心5 min，去胰蛋白酶。采用稀釋緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至5×105個/ml。取195 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC混合，室溫下反應(yīng)。加入10 μl碘化丙啶（PI，20μg/ml），反應(yīng)10 min后上機(jī)檢測各細(xì)胞水平。

1.4 實(shí)時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）將巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞分別以5×105個/孔接種到6孔板并培養(yǎng)至生長對數(shù)期，按照要求分別加入In-NC（NC組）、miR-146a mimics（模擬物組）、miR-146a inhibits（抑制劑組）、miR-146a mimics+ NF-κB抑制劑（模擬物+PDTC組）、miR-146a inhibits+NF-κB抑制劑（抑制劑+PDTC組），然后經(jīng)Li-pofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后加入Trizol消化各組細(xì)胞，按照TRIzol Reagent（Invitrogen公司，USA）說明書提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度。采用TransScript? One-Step RT-PCR和TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis（北京全式金生物工程有限公司）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。再行熒光定量PCR擴(kuò)增基因片段，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共45個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NF-κB通路p65、p50及ABCA1的mRNA相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 Western blotting法 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后采用含0.1% PMSF的RIPA裂解液消化、收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。每組取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。使用ABCA1、NF-κB和β-actin一抗（1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜；再加入標(biāo)記IRDye800的二抗（1∶2 000在PBS中稀釋），4 ℃孵育過夜。采用TBST洗滌后，紅外熒光成像系統(tǒng)（Rockland）掃描分析NF-κB通路p65、p50及ABCA1的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 3'UTR熒光素酶報(bào)告基因檢測 通過RT-PCR從巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞RNA中擴(kuò)增ABCA1 3'UTR片段，并定向克隆到psiCHECKTM-2載體（Promega）中的海腎熒光素酶開放閱讀框的下游，該載體還包含組成型表達(dá)的螢火蟲熒光素酶基因。通過Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）在線軟件預(yù)測得出，人的ABCA1 3'UTR具有兩個miR-146a結(jié)合位點(diǎn)：位點(diǎn)2在物種之間高度保守，位點(diǎn)1僅在人類和靈長類動物中保守，見圖2。為了評估m(xù)iR-146a對人ABCA1 3'UTR的影響，本研究使用了報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒與miR-146a共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，并分別轉(zhuǎn)染陰性對照模擬物——Con-miR（Con-miR組）及不同濃度（10 nmol/L和20 nmol/L）miR-146a（10 nmol/L miR-146a組和20 nmol/L miR-146a組）。之后使用Multisite-Quickchange（Stratagene公司）在ABCA1的3'UTR內(nèi)預(yù)測miR-146a位點(diǎn)的區(qū)域中進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建兩個位點(diǎn)的突變載體（SDM1和SDM2），并通過測序確認(rèn)所構(gòu)建載體序列的準(zhǔn)確性。將野生型（WT）3'UTR熒光素酶報(bào)告載體分別用Li-pofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Con-miR（WT+Con-miR組）和miR-146a（WT+miR-146a組），將1 μg的SDM1和/或SDM2 3'UTR熒光素酶報(bào)告載體分別用Li-pofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-146a（分為 SDM1+miR-146a組、SDM2+miR-146a組、SDM1/SDM2+miR-146a組）。使用Dual-Glo螢光素酶測定系統(tǒng)（Promega）測量螢光素酶活性，將海腎熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為相應(yīng)的螢火蟲熒光素酶活性。

圖2 miR-146a與ABCA1 3'UTR結(jié)合情況Figure 2 Predicted annealing of miR-146a to the ABCA1 3'UTR

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)4次，符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出效率的影響 空白對照組膽固醇流出效率為（21.38±8.94）%，陽性對照組為（58.63±7.31）%，陰性對照組為（14.55±5.72）%，模擬物組為（17.08±4.13）%，抑制劑組為（56.03±5.88）%。五組膽固醇流出效率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.43，P=0.02）；陽性對照組膽固醇流出效率高于空白對照組，陰性對照組和模擬物組膽固醇流出效率低于陽性對照組，抑制劑組膽固醇流出效率高于空白對照組、陰性對照組和模擬物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 miR-146a對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 各組正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模擬物組正常細(xì)胞水平低于NC組，抑制劑組正常細(xì)胞水平高于NC組和模擬物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模擬物組壞死細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞水平高于NC組，抑制劑組壞死細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞水平低于NC組和模擬物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖3。

表2 三組正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞水平比較（±s，%，n=4）Table 2 Comparison of levels of normal cells，necrotic cells and apoptotic cells among the three groups

表2 三組正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞水平比較（±s，%，n=4）Table 2 Comparison of levels of normal cells，necrotic cells and apoptotic cells among the three groups

注：與NC組比較，aP＜0.05；與模擬物組比較，bP＜0.05

組別 正常細(xì)胞 壞死細(xì)胞 晚期凋亡細(xì)胞 早期凋亡細(xì)胞NC 組 83.28±2.62 4.56±1.20 4.49±0.14 8.72±1.25模擬物組 78.37±8.22a 5.13±2.06a 8.69±2.15a 9.07±1.52a抑制劑組 98.63±7.28ab0.25±0.05ab 0.13±0.06ab 0.59±0.07ab F值 2.13 5.61 6.17 5.22 P值 0.04 0.01 0.01 0.01

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡情況Figure 3 Apoptosis of macrophage-derived foam cells by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry

2.3 抑制NF-κB通路對miR-146a及ABCA1表達(dá)的影響各組NF-κB通路p50、p65及 ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；模擬物組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對表達(dá)量高于NC組，ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模擬物+PDTC組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對表達(dá)量低于模擬物組，ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量高于模擬物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。抑制劑組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對表達(dá)量低于NC組，ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；抑制劑+PDTC組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對表達(dá)量高于抑制劑組，ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量低于抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組NF-κB通路p50、NF-κB通路p65、ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=4）Table 3 Comparison of the mRNA and protein relative expression levels of NF-κB pathway p50，NF-κB pathway p65 and ABCA1 in each group

表3 各組NF-κB通路p50、NF-κB通路p65、ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=4）Table 3 Comparison of the mRNA and protein relative expression levels of NF-κB pathway p50，NF-κB pathway p65 and ABCA1 in each group

注：與NC組比較，aP＜0.05；與模擬物組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05

mRNANF-κB通路p50蛋白NF-κB通路p65 mRNANF-κB通路p65蛋白ABCA1 mRNAABCA1蛋白NC 組 1.08±0.15 1.02±0.05 1.07±0.13 1.03±0.08 1.14±0.21 1.08±0.20模擬物組 3.02±0.28a 4.16±0.52a 2.78±0.25a 2.84±0.34a 0.28±0.04a 0.31±0.08a模擬物 +PDTC 組 1.43±0.21b 2.08±0.17b 1.11±0.13b 1.02±0.11b 0.95±0.24b 1.13±0.24b抑制劑組 0.41±0.08a 0.85±0.11a 0.61±0.09a 0.63±0.02a 1.68±0.21a 1.73±0.33a抑制劑 +PDTC 組 0.82±0.12c 1.53±0.25c 0.98±0.09c 1.03±0.13c 1.22±0.18c 1.27±0.23c F值 5.21 3.07 6.29 3.15 3.62 5.22 P值 0.02 0.02 0.01 0.03 0.03 0.01組別 NF-κB通路p50

2.4 miR-146a靶向結(jié)合ABCA1 3'UTR情況 Con-miR組ABCA1 3'UTR活性為（100.18±6.12），10 nmol/L miR-146a組 為（53.27±10.18），20 nmol/L miR-146a組為（60.18±8.37）；三組ABCA1 3'UTR活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.16，P=0.030）；10 nmol/L miR-146a組和20 nmol/L miR-146a組ABCA1 3'UTR活性低于Con-miR組，20 nmol/L miR-146a組ABCA1 3'UTR活性低于10 nmol/L miR-146a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。WT+Con-miR組ABCA1 3'UTR活性為（100.03±5.28），WT+miR-146a組為（70.18±8.33），SDM1+miR-146a組 為（82.37±11.27），SDM2+miR-146a組為（117.35±6.58），SDM1/SMD2+miR-146a組為（124.10±9.57）；各組ABCA1 3'UTR活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.52，P=0.01）；WT+miR-146a組和SDM1+miR-146a組ABCA1 3'UTR活性低于WT+Con-miR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SDM2+miR-146a組和SDM1/SMD2+miR-146a組ABCA1 3'UTR活性與WT+Con-miR組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

細(xì)胞膽固醇水平的調(diào)控包括膽固醇攝取、內(nèi)源性合成和外排之間的平衡。既往研究表明，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)紊亂可導(dǎo)致多種疾病，包括AS、代謝綜合征、2型糖尿病及阿爾茨海默病等［8］。巨噬細(xì)胞膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)失衡貫穿泡沫細(xì)胞形成的整個過程，而膽固醇流出是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇動態(tài)平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積、防止泡沫細(xì)胞形成和AS發(fā)生具有重要意義。研究表明，抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積（泡沫化）和炎癥因子釋放是防治AS的重要途徑［4，9］。本研究通過ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了基礎(chǔ)。

研究表明，高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）及其主要載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，ApoA1）在去除細(xì)胞中多余膽固醇及其向肝臟運(yùn)輸過程中起關(guān)鍵作用，這一過程稱為膽固醇逆向運(yùn)輸［10］。當(dāng)多余的膽固醇來自動脈斑塊中的泡沫細(xì)胞時，膽固醇逆向運(yùn)輸被認(rèn)為是HDL抗AS的基礎(chǔ)［11］。ABCA1和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1（ABCG1）可促進(jìn)膽固醇從包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的外周細(xì)胞中流出，此外ABCA1還負(fù)責(zé)啟動肝臟中的HDL形成，如Tangier?。ㄒ环N以血漿HDL較低為特征的疾病）的發(fā)生與ABCA1基因突變密切相關(guān)［12］。miR-146a是一個典型的多功能miR，可在其下游基因的介導(dǎo)下參與免疫、炎癥、腫瘤等多種生理病理過程［13-15］。研究發(fā)現(xiàn)，動脈硬化病變越嚴(yán)重，miR-146a表達(dá)水平越高［7］。但泡沫細(xì)胞中miR-146a與ABCA1的關(guān)系尚不清楚。本研究結(jié)果表明，miR-146a可通過抑制ABCA1表達(dá)而抑制其介導(dǎo)的膽固醇流出。

本研究進(jìn)一步分析了miR-146a對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146a mimics促進(jìn)了巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的凋亡，提示miR-146a對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)展具有重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是miR-146a參與AS的最重要信號通路之一，其在LPS、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）誘導(dǎo)的miR-146a轉(zhuǎn)錄過程中起關(guān)鍵作用［16］。本研究結(jié)果顯示，模擬物+PDTC組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對表達(dá)量低于模擬物組，ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量高于模擬物組；抑制劑+PDTC組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對表達(dá)量低于抑制劑組，ABCA1的mRNA、蛋白相對表達(dá)量高于抑制劑組，提示miR-146a對NF-κB存在依賴性。

研究證實(shí)，ABCA1的3'UTR長于其他與AS相關(guān)的基因，是多個miR的靶標(biāo)［17］。如miR-122能靶向沉默ABCA1，在小鼠和非人類的靈長類動物中的沉默降低了膽固醇的合成及肝臟脂肪酸、血漿膽固醇水平，并增加肝臟脂肪酸β-氧化［18-19］。與miR-122相反，miR-758在不同組織和細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，其對ABCA1的作用影響了細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABCA1 3'UTR具有兩個miR-146a結(jié)合位點(diǎn)，其中1個位點(diǎn)消除了miR-146a對ABCA1 3' UTR活性的抑制作用。

綜上所述，miR-146a可通過抑制ABCA1表達(dá)而抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出，從而導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展，而NF-κB可以減輕miR-146a對ABCA1表達(dá)的抑制作用。后續(xù)應(yīng)研究miR-146a的有效調(diào)控方法，進(jìn)而為防止脂質(zhì)在血管壁蓄積及治療AS提供新的靶點(diǎn)。

作者貢獻(xiàn)：幸世峰和駱小梅進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；孫理華進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理、分析，論文的修訂；幸世峰進(jìn)行結(jié)果分析與解釋，撰寫論文；駱小梅負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。