王彥鈞 曾瑋瑋 朱建儒 王 靜 李素霞 陳東風(fēng) 鄧天偉 楊 敏&

陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心大坪醫(yī)院消化內(nèi)科1(400042)北京大學(xué)中國(guó)藥物依賴性研究所2 重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院消化內(nèi)科3

背景：腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)患者的癥狀具有晝夜波動(dòng)等節(jié)律紊亂特征，但其病理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚。目的：探討結(jié)腸生物鐘基因Bmal1在IBS-D患者癥狀發(fā)生中的作用及其可能機(jī)制。方法：于2018年9月—2021年2月在陸軍特色醫(yī)學(xué)中心納入46例IBS-D患者和34例正常對(duì)照者參與研究。以IBS嚴(yán)重程度評(píng)分系統(tǒng)(IBS-SSS)評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度。結(jié)腸鏡檢查時(shí)在直腸乙狀結(jié)腸交界處取活檢，以ELISA法檢測(cè)5-羥色胺(5-HT)含量，免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)Bmal1和腸嗜鉻細(xì)胞(EC細(xì)胞)標(biāo)記物嗜鉻粒蛋白A(CgA)表達(dá)。結(jié)果：IBS-D患者結(jié)腸黏膜中的5-HT含量、EC細(xì)胞數(shù)量均顯著高于正常對(duì)照組(P均<0.05)。Bmal1主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞，其與CgA存在共表達(dá)，且在EC細(xì)胞中呈高表達(dá)。與同時(shí)間點(diǎn)取材的正常對(duì)照組相比，上午9∶00取材的IBS-D患者結(jié)腸Bmal1表達(dá)顯著升高，下午17∶00取材者Bmal1表達(dá)則顯著降低(P均<0.05)。Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，上午9∶00取材的IBS-D患者結(jié)腸Bmal1表達(dá)與IBS-SSS總分和腹痛不適評(píng)分呈顯著正相關(guān)(rs=0.413, P=0.023; rs=0.546, P=0.001)。結(jié)論：IBS-D患者存在結(jié)腸生物鐘基因Bmal1表達(dá)紊亂，Bmal1振蕩或可通過(guò)影響EC細(xì)胞的5-HT分泌參與IBS-D癥狀發(fā)生。

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一種常見的功能性胃腸病，不同研究報(bào)道的人群患病率從1.1%到45%不等[1]，患者生活質(zhì)量受到不同程度的影響，并造成巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。IBS患者具有多種癥候群，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹部不適伴排便習(xí)慣改變，并有晝夜波動(dòng)、時(shí)輕時(shí)重，以及與其他功能性胃腸病重疊或轉(zhuǎn)換等節(jié)律紊亂特征[2-3]。既往研究發(fā)現(xiàn)腸-腦軸、內(nèi)臟高敏感、腸道動(dòng)力異常、黏膜屏障異常、腸道微生態(tài)改變、免疫紊亂等機(jī)制共同參與了IBS的發(fā)病，但上述理論均難以全面解釋 IBS癥狀的節(jié)律紊亂特征。

哺乳動(dòng)物的生物鐘基因主要由正向調(diào)控因子Clock、Bmal1等與負(fù)向調(diào)控因子Per(period 1-3)、Cry(cryptochrome 1-2)等組成[4]。其中，Bmal1是最重要的生物鐘正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，是參與生物鐘正、負(fù)反饋通路的核心元件。在持續(xù)的黑暗環(huán)境中，Bmal1基因敲除小鼠表現(xiàn)為生物節(jié)律性完全消失[5]。腸道生物鐘基因及其晝夜節(jié)律在功能性腸病發(fā)生中起有不可忽視的作用并逐漸得到研究者的關(guān)注[2-3,6-9]。目前，國(guó)內(nèi)外鮮見有關(guān)結(jié)腸生物鐘基因振蕩在IBS癥狀晝夜波動(dòng)中作用及其發(fā)生機(jī)制的研究報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)腹瀉型ISB(IBS with diarrhea, IBS-D)患者的結(jié)腸生物鐘基因Bmal1表達(dá)以及5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)以及5-HT分泌細(xì)胞腸嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cells, EC細(xì)胞)的特異性標(biāo)記物嗜鉻粒蛋白A(chromo-granin A, CgA)表達(dá)，并評(píng)估患者的病情嚴(yán)重程度，旨在探討結(jié)腸生物鐘基因Bmal1在IBS-D癥狀發(fā)生中的作用及其可能機(jī)制，以期為IBS的臨床診治提供新思路。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

根據(jù)羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)[10]，于2018年9月—2021年2月從陸軍特色醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科門診連續(xù)收集IBS-D患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①任何影響IBS-D的全身性疾病或消化系統(tǒng)器質(zhì)性疾病，如消化道外腫瘤、消化道潰瘍或腫瘤、胰腺炎、膽系疾病等；②消化道手術(shù)史；③神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)疾病，如甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病等；④因精神心理疾病無(wú)法完成問(wèn)卷；⑤最近3個(gè)月服用過(guò)激素或免疫調(diào)節(jié)劑。結(jié)果共46例患者納入研究，其中男性21例，女性25例，年齡20～65歲，平均(47.51±12.80)歲。同期招募健康志愿者34例作為正常對(duì)照組，其中男性16例，女性18例，年齡20～65歲，平均(45.60±12.74)歲。IBS-D組與正常對(duì)照組間性別構(gòu)成、平均年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。研究方案經(jīng)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有參與試驗(yàn)者均簽署知情同意書，對(duì)樣本采集知情同意。

二、方法

1. 樣本采集：使用Olympus內(nèi)鏡系統(tǒng)(CLV-290SL)行結(jié)腸鏡檢查并取活檢，活檢部位統(tǒng)一為直腸乙狀結(jié)腸交界處。取材時(shí)間點(diǎn)分別為上午9∶00(IBS-D組20例，正常對(duì)照組18例)和下午17∶00(IBS-D組26例，正常對(duì)照組16例)。

2. 病情嚴(yán)重程度評(píng)估：采用 IBS嚴(yán)重程度評(píng)分系統(tǒng)(IBS-severity scoring system, IBS-SSS[11])評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度，由患者自評(píng)。該量表包括腹痛不適、每10 d中腹痛發(fā)作天數(shù)、當(dāng)天腹脹不適程度、對(duì)大便情況的滿意度和腸道癥狀對(duì)生活的干擾五個(gè)條目，每一條目評(píng)分0～100 分，總分為500 分，評(píng)分越高表明病情越重。

3. ELISA法檢測(cè)結(jié)腸黏膜5-HT含量：制備結(jié)腸組織勻漿，離心、取上清液，參照ELISA試劑盒(Enzo Biochem Inc.)說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)5-HT含量，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為上午9∶00。

4. 免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸黏膜CgA、Bmal1表達(dá)：結(jié)腸標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片；脫蠟、微波抗原修復(fù)20 min，5% BSA封閉15 min；一抗孵育：兔源CgA一抗(1∶200, Abcam plc.)，鼠源Bmal1一抗(1∶200, Novus Biologicals)，濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜；二抗孵育：Alexa Fluor 488標(biāo)記(綠色熒光)羊抗兔IgG(1∶500, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)，CY3標(biāo)記(紅色熒光)羊抗小鼠IgG(1∶500,武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司)，加入二抗1 h后，濕盒中37 ℃孵育過(guò)夜；于樣品上滴加適量免洗細(xì)胞核染料DAPI(藍(lán)色熒光；碧云天生物)，1周內(nèi)免疫熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡拍照，ImageJ 6.0軟件分析熒光強(qiáng)度。此外，每張CgA免疫熒光標(biāo)記切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)CgA陽(yáng)性EC細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、IBS-D患者結(jié)腸5-HT和EC細(xì)胞變化

ELISA法檢測(cè)顯示，IBS-D患者結(jié)腸黏膜中的5-HT含量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(63.17±15.69) ng/mL對(duì)(25.52±7.80) ng/mL,P<0.001]；根據(jù)CgA免疫熒光計(jì)數(shù)EC細(xì)胞，IBS-D患者結(jié)腸EC細(xì)胞數(shù)量也較正常對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.57±0.91對(duì)1.28±0.70,P<0.05；圖1)。

圖1 IBS-D患者(A)和正常對(duì)照者(B)結(jié)腸黏膜CgA免疫熒光標(biāo)記(×400)

二、IBS-D患者結(jié)腸Bmal1表達(dá)及其與IBS-SSS評(píng)分的相關(guān)性

免疫熒光和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)顯示，結(jié)腸生物鐘基因Bmal1主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞。與同時(shí)間點(diǎn)取材的正常對(duì)照組相比，上午9∶00取材的IBS-D患者結(jié)腸Bmal1表達(dá)明顯升高，下午17∶00取材的IBS-D患者結(jié)腸Bmal1表達(dá)明顯降低，同時(shí)下午17∶00取材的IBS-D患者結(jié)腸Bmal1表達(dá)也較上午9∶00取材的IBS-D患者明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001；圖2、圖3)，提示IBS-D患者的Bmal1表達(dá)具有時(shí)間差異性，并與健康人存在顯著差異。

A：IBS-D患者上午9∶00取材；B：正常對(duì)照者上午9∶00取材；C：正常對(duì)照者下午17∶00取材；D：IBS-D患者下午17∶00取材

兩組間比較，***P<0.001

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，上午9∶00取材的IBS-D患者結(jié)腸Bmal1表達(dá)與IBS-SSS總分和腹痛不適評(píng)分呈顯著正相關(guān)(rs=0.413,P=0.023;rs=0.546,P=0.001)，與每10 d中腹痛發(fā)作天數(shù)、當(dāng)天腹脹不適程度、對(duì)大便情況的滿意度、腸道癥狀對(duì)生活的干擾四項(xiàng)評(píng)分均無(wú)相關(guān)性(rs=0.151,P=0.408;rs=0.269,P=0.137;rs=0.047,P=0.799;rs=0.201,P=0.269)。

三、EC細(xì)胞Bmal1與CgA共表達(dá)情況

采用連續(xù)切片免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)將相鄰的2張切片分別用于Bmal1和CgA染色，結(jié)果顯示IBS-D患者的結(jié)腸生物鐘基因Bmal1與EC細(xì)胞標(biāo)記物CgA存在共表達(dá)，且在EC細(xì)胞中呈高表達(dá)(圖4)。

A：EC細(xì)胞CgA表達(dá)(綠色熒光)；B：EC細(xì)胞Bmal1表達(dá)(紅色熒光)；C：細(xì)胞核DAPI染色(藍(lán)色熒光)；D：EC細(xì)胞Bmal1與CgA共表達(dá)；E：Bmal1、CgA與細(xì)胞核(DAPI)合并熒光圖

討 論

生物鐘是生物體內(nèi)一種無(wú)形的“時(shí)鐘”，可使機(jī)體的行為、生理和新陳代謝的內(nèi)部循環(huán)與外界環(huán)境周期性同步。晝夜節(jié)律是指生命活動(dòng)以24 h左右為周期的節(jié)律性變化，機(jī)體的生理功能和行為活動(dòng)與存在于分子、細(xì)胞、組織、器官和整體水平的晝夜節(jié)律密切相關(guān)[4]。對(duì)生物鐘及其晝夜節(jié)律分子機(jī)制研究的重大突破性成果獲得了2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[12]。目前在哺乳動(dòng)物小鼠體內(nèi)已克隆鑒定出了十余種生物鐘相關(guān)基因，分別為Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock(circadian locomotor cycle kaput)、Bmal1(Brain and muscle Arnt-like protein 1)、Timless、Npas2、Dec1-2、Rev-erba等。這些基因與其蛋白質(zhì)產(chǎn)物構(gòu)成自主調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯反饋環(huán)，維持內(nèi)源性生物鐘運(yùn)作，形成生物鐘運(yùn)轉(zhuǎn)的正、負(fù)反饋機(jī)制[4,12]。晝夜節(jié)律由視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)中樞生物鐘和與其關(guān)聯(lián)的外周生物鐘共同控制。外周生物鐘在一定程度上獨(dú)立于SCN，指導(dǎo)著一些特定的節(jié)律性生理活動(dòng)[12]。對(duì)外周生物鐘系統(tǒng)的探索是生物節(jié)律研究領(lǐng)域最新的深層次研究方向。腸道生物鐘基因Bmal1如何參與IBS內(nèi)臟敏感性晝夜節(jié)律紊亂的形成是一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題，深入探討其相關(guān)機(jī)制對(duì)于IBS的治療具有重要意義。

腸道生物鐘基因及其晝夜節(jié)律在功能性腸病發(fā)生中的作用日益受到重視[2-3,6-9]?，F(xiàn)有研究證實(shí)，輪班工作、跨時(shí)區(qū)飛行導(dǎo)致的晝夜節(jié)律紊亂可增加IBS的發(fā)生，誘導(dǎo)IBS樣癥狀，與IBS的腹痛、腹瀉、便秘等癥狀密切相關(guān)。Nojkov等[8]對(duì)399名護(hù)士的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，輪班工作對(duì)IBS和腹痛患病率有顯著影響，輪班護(hù)士的IBS患病率(48%)和腹痛患病率(81%)均顯著高于日班護(hù)士(31%和54%)。有證據(jù)表明，生物鐘及其晝夜節(jié)律紊亂可能通過(guò)影響腸-腦軸促使IBS發(fā)生[2-3,13]。本課題組前期研究表明：①在特定應(yīng)激狀態(tài)下，功能性胃腸病(包括功能性消化不良、IBS)患者存在生物鐘節(jié)律紊亂，并與其焦慮、抑郁程度呈正相關(guān)[14]。②應(yīng)激性IBS動(dòng)物模型存在廣泛的內(nèi)臟敏感性改變，即痛覺(jué)敏化/去敏化現(xiàn)象[15]。 本研究通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸生物鐘基因Bmal1主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞，其與EC細(xì)胞標(biāo)記物CgA存在共表達(dá)，且在EC細(xì)胞中呈高表達(dá)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)IBS-D患者的Bmal1表達(dá)具有時(shí)間差異性，并與健康人存在顯著差異；其表達(dá)與患者的總體病情嚴(yán)重程度和腹痛不適癥狀呈顯著正相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)為結(jié)腸生物鐘基因及其晝夜節(jié)律參與IBS內(nèi)臟敏感性晝夜節(jié)律紊亂的形成提供了有力證據(jù)。

已知EC細(xì)胞及其分泌的5-HT和5-HT合成限速酶色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase 1, TPH1)相關(guān)信號(hào)通路在IBS腸道動(dòng)力異常和內(nèi)臟高敏感的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，是IBS發(fā)生最重要的病理生理學(xué)機(jī)制[16-17]。EC細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞中一種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，盡管其僅占腸上皮細(xì)胞數(shù)量的1%，但體內(nèi)約90%的5-HT系由EC細(xì)胞分泌。5-HT通過(guò)激活腸黏膜上皮、黏膜下層或肌間神經(jīng)叢的 5-HT 受體發(fā)揮重要作用。研究[17]顯示炎癥后IBS(PI-IBS)大鼠模型結(jié)腸EC 細(xì)胞計(jì)數(shù)、5-HT水平和TPH表達(dá)顯著增高，同時(shí)內(nèi)臟疼痛閾值明顯降低；而槲皮素干預(yù)可顯著降低結(jié)腸EC細(xì)胞密度、5-HT水平和TPH表達(dá)，并提高內(nèi)臟疼痛閾值，槲皮素對(duì) PI-IBS 的鎮(zhèn)痛作用至少部分是通過(guò)抑制EC細(xì)胞的TPH-5-HT通路實(shí)現(xiàn)的。既往研究顯示，中樞水平的5-HT受晝夜振蕩節(jié)律調(diào)節(jié)[18]，同樣，光照明暗變化可影響十二指腸的5-HT分泌[19]。由此推測(cè)，結(jié)腸生物鐘基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)5-HT分泌參與了IBS-D癥狀的發(fā)生。

機(jī)械敏感性離子通道蛋白基因Piezo2特異性表達(dá)于EC細(xì)胞。通過(guò)JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)Piezo2基因啟動(dòng)子區(qū)域存在由Bmal1基因調(diào)控的E-box元件(CACGTG)，提示其為Bmal1下游的鐘控基因，Bmal1可能通過(guò)調(diào)節(jié)EC細(xì)胞的Piezo2基因轉(zhuǎn)錄，引起Piezo2依賴性的細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，進(jìn)而引發(fā)5-HT釋放增多，參與IBS內(nèi)臟高敏感的形成[20-21]。本研究結(jié)果表明，IBS-D患者存在結(jié)腸生物鐘基因Bmal1表達(dá)紊亂、結(jié)腸EC細(xì)胞數(shù)量增多和5-HT分泌異常。結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)道和本研究結(jié)果，推測(cè)Bmal1可能通過(guò)與EC細(xì)胞上的Piezo2基因啟動(dòng)子區(qū)E-box元件結(jié)合調(diào)節(jié)其晝夜振蕩以及Piezo2依賴性Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而引發(fā)5-HT分泌的晝夜振蕩，最終導(dǎo)致IBS-D癥狀發(fā)生，但該過(guò)程涉及的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。從生物鐘紊亂角度認(rèn)識(shí)IBS的發(fā)生機(jī)制，為臨床探討難治性或晝夜節(jié)律紊亂相關(guān)IBS的治療奠定了理論基礎(chǔ)。