杜 倩，汪 偉,，韓知曉，孔子榮，辛佳亮，閉璟珊,曹 亮，孫文超,4，胡傳活，鄭 敏

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530004；2. 廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病控制中心，南寧530000；3.軍事科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春130122；4.溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所，溫州325035）

豬德爾塔冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是冠狀病毒科（Coronaviridae）德爾塔冠狀病毒屬（Deltacoronavirus）成員[1-3]，其病毒粒子呈球形或多形性，基因組大小為25.4～ 26.6 kb，包含至少7個(gè)開放閱讀框[4]。

2012年，Woo等[5]首次從香港地區(qū)豬腹瀉樣品中檢測(cè)到PDCoV，隨后美國、加拿大、泰國和韓國等國家也相繼從臨床樣本中檢測(cè)到PDCoV[4,6-9]。方譜縣等[10]對(duì)多個(gè)國家和地區(qū)的PDCoV基因組序列進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的PDCoV毒株之間核酸同源性較高，表明PDCoV可能具有相同的起源。資料顯示，PDCoV對(duì)不同日齡、性別和品種的豬均有致病性，對(duì)哺乳仔豬的致病性最強(qiáng)，病死率高達(dá)30%[11]。此外，PDCoV常與豬流行性腹瀉病毒（Porcine epiddmic diarrhea virus，PEDV）和傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastrpenteritis virus，TGEV）混合感染，臨床上表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水以及食欲衰退等癥狀[1,12-14]。臨床剖檢可見病豬多臟器出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性病變，尤其是小腸部位病變最為嚴(yán)重，腸絨毛皺縮、腸壁變薄以及腸腔內(nèi)存在大量黃色液體[4,10,15]。

為了能更好的了解廣西地區(qū)PDCoV流行情況和分子遺傳變異情況，本研究初步建立了針對(duì)PDCoV S基因的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證和初步應(yīng)用，結(jié)果證明該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好。

1 材料與方法

1.1 病毒和試劑 豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒的陽性樣品由廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心采集并保存；RNA提取試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；TIANprep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收DNA純化試劑盒、2×Taq PCR Master Mix購于天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T載體、AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司；Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)PDCoVS基因序列（GenBank登錄號(hào)：KY363867.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PDS-F：5'-CAATTTTAGCAGCATA CTAACCACCA-3'，PDS-R：5'-CATTTTCTCAG CATCAACAACACCAG-3'。擴(kuò)增目的片段大小為208 bp，引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.3 病毒RNA提取 按照試劑盒說明從臨床樣本中提取RNA，并置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備 將所提取的RNA按照AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA的合成。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix聚合酶25.0 μL，PDS-F/R（10 pmol/μL）各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 21 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s；57℃退火30 s；72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，12℃保存。目的片段經(jīng)膠回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒送吉林庫美省庫科技公司測(cè)序。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及條件優(yōu)化

1.5.1 反應(yīng)體系及條件 選取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算OD260/OD280比值，計(jì)算重組質(zhì)粒的濃度和純度。取OD260/OD280比值范圍在1.8～2.0的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，拷貝數(shù)濃度為6.26×1010copies/μL，對(duì)其進(jìn)行10倍梯度稀釋。取6.26×101～6.26×108copies/μL稀釋度的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過多次梯度試驗(yàn)，對(duì)引物工作濃度、聚合酶工作濃度和延伸溫度等條件進(jìn)行篩選，最終確定反應(yīng)體系如下：PDS-F/R（10 pmol/mL）各0.5 μL，模板1.0 μL，2×SYBR Green real-time PCR Master Mix 10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.5.2 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選取6.26×108、6.26×107、6.26×106、6.26×105、6.26×104、6.26×103、6.26×102、6.26×101copies/μL的重組質(zhì)粒為模板，利用上述優(yōu)化的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍倍比稀釋作為模板，并設(shè)空白對(duì)照組，進(jìn)行SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的最小拷貝數(shù)。

1.7 特異性試驗(yàn) 提取PDCoV、PEDV和TGEV陽性樣本的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 以1 0倍倍比稀釋3個(gè)梯度（6.26×106～6.26×104copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行組間和組內(nèi)平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，分析試驗(yàn)的重復(fù)性，計(jì)算組間和組內(nèi)的Ct值。

1.9 臨床樣品的檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說明書提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為檢測(cè)模板使用，利用本研究建立的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)采集并保存的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒鑒定 利用設(shè)計(jì)好的PDCoV特異性引物擴(kuò)增出目的片段，大小為208 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。將目的片段克隆到pMD19-T載體構(gòu)建模板質(zhì)粒pMD19T-PDCoV，經(jīng)PCR鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的PDCoV序列進(jìn)行比對(duì)，同源性為100%。

圖1 PDCoV S基因的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR amplification of PDCoV S gene

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選取6.26×101～6.26×108copies/μL濃度的重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行SYBR Green Ⅰ real-time PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值和重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性函數(shù)為y=-4.312x+45.401，R2為0.999（圖2）。

圖2 PDCoV S基因SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of PDCoV S genes by SYBR GreenⅠreal- time PCR

2.3 敏感性檢測(cè) 取6.26×101～6.26×108copies/μL范圍內(nèi)的重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)體系中含有6.26×101copies/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒時(shí)仍能產(chǎn)生特異性擴(kuò)增（圖3），而陰性對(duì)照無特異性擴(kuò)增。

圖3 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性分析Fig.3 Sensitivity analysis of the SYBR GreenⅠreal-time PCR

2.4 特異性檢測(cè) 以PDCoV、PEDV和TGEV的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，驗(yàn)證方法的特異性。結(jié)果顯示，PDCoV組出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，而PEDV組和TGEV組未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增（圖4）。

圖4 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR特異性分析Fig.4 Specific analysis of the SYBR GreenⅠreal-time PCR

2.5 重復(fù)性檢測(cè) 將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間變異系數(shù)為0.61%～0.75%，組內(nèi)變異系數(shù)為1.14%～1.23%，表明建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法組間和組內(nèi)都具有良好的重復(fù)性（表1）。

表1 PDCoV熒光定量PCR檢測(cè)重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 Repeatability assay of PDCoV florescence quantitative real-time PCR

2.6 熔解曲線分析 本試驗(yàn)利用優(yōu)化的條件進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在熔解溫度為82.6℃處出現(xiàn)單一的溶解峰（圖5）。

圖5 PDCoV S基因 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熔解曲線Fig.5 Melting curve of PDCoV S genes by SYBR Green I real-time PCR

2.7 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 利用本試驗(yàn)建立的方法，對(duì)2017-2018年從廣西多個(gè)地區(qū)采集的43份豬腹瀉糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，2份樣品為陽性，陽性率為4.6%（圖6）。

圖6 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR臨床樣品檢測(cè)Fig.6 SYBR GreenⅠreal-time PCR clinical sample testing

3 討論

冠狀病毒為單股正鏈RNA病毒，是目前已知RNA病毒中基因組最大的一類病毒[15]。自2012年，PDCoV首次在香港被發(fā)現(xiàn)，至今已在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，嚴(yán)重影響各國養(yǎng)豬行業(yè)的發(fā)展。美國豬腹瀉樣品的PDCoV感染率為30%[7]，PDCoV在我國江蘇省、安徽省、廣東省、河南省、廣西壯族自治區(qū)等地區(qū)的豬場(chǎng)中同樣存廣泛在。對(duì)腹瀉豬的糞便和腸道樣本的檢查結(jié)果顯示，PDCoV感染率高達(dá)31.33%[16-17]。由于PDCoV在病理變化、流行病學(xué)和臨床癥狀上與PEDV和TGEV都極其相似[18]，所以需要借助核酸或血清學(xué)檢測(cè)手段方能對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別診斷。目前針對(duì)PDCoV病原的檢測(cè)包括常規(guī)RT-PCR、巢式PCR、免疫組織化學(xué)分析以及ELISA等[19-21]，這些方法存在靈敏度和特異性差，且無法準(zhǔn)確分辨病毒種類的缺點(diǎn)。同時(shí)，上述診斷方法還存在實(shí)際操作費(fèi)時(shí)、工作量大以及樣品容易污染等問題。和上述檢測(cè)方法相比，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法不僅具有操作簡(jiǎn)便、成本低、可避免污染及進(jìn)行定量分析等優(yōu)點(diǎn)，該方法還可對(duì)試驗(yàn)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)檢測(cè)，快速完成診斷任務(wù)。雖然目前針對(duì)PDCoV已存在相應(yīng)的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，但大多是針對(duì)PDCoV M和N基因的保守序列所設(shè)計(jì)的，這些檢測(cè)方法的普遍性和適用性還有待考證。因此針對(duì)檢測(cè)PDCoV不同保守基因來建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，對(duì)于補(bǔ)充PDCoV檢測(cè)技術(shù)的普遍性和適用性是十分必要的。

本研究針對(duì)PDCoV的S基因，建立了一種簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確的SYBR GreenⅠreal-time PCR檢測(cè)方法。此方法的敏感度可達(dá)到6.26×101copies/μL；重復(fù)性良好，組內(nèi)變異系數(shù)為0.61%～0.75 %，組間變異系數(shù)為1.14 %～1.23%。對(duì)PEDV和TGEV均無特異性擴(kuò)增，證明該方法特異性良好。運(yùn)用本研究建立的方法對(duì)43份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽性率為4.6%。結(jié)果表明，本研究成功建立了對(duì)PDCoV S基因的SYBR GreenⅠreal-time PCR檢測(cè)方法，為今后了解國內(nèi)豬群中PDCoV流行情況及豬冠狀病毒相關(guān)疫苗研究提供了科學(xué)依據(jù)。