楊 陽 ，曹 偉 ，潘 永 ，段世宇 ，楊 琦 ,4

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽550025；2.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴陽550025；3.巴彥淖爾市獸醫(yī)事業(yè)管理局，巴彥淖爾015000；4.貴州省動物疫病研究室，貴陽550025）

沙門菌（Salmonella）是一種嚴(yán)重危害人類與動物健康的革蘭氏陰性菌，能夠?qū)е氯伺c動物發(fā)生腸炎、食物中毒、敗血癥等一系列粘膜免疫反應(yīng)疾病，還可造成母畜流產(chǎn)、死亡，在中國所發(fā)生的食物中毒原因中有70%～80%由沙門菌引起。沙門菌對我國動物福利和公共衛(wèi)生問題有著巨大的影響[1-4]。在沙門菌中，aphA基因可編碼蛋白B類酸性磷酸酶（class B acid phosphatase/phosphotransferase），這類酶的主要生理功能包括：催化和水解多種磷酸底物，催化低能量的磷酸集團從磷酸單酯向羥基集團的轉(zhuǎn)移[5]。在細(xì)菌中，磷酸集團的轉(zhuǎn)移是細(xì)菌能量代謝的主要途徑之一，若破壞磷酸集團的催化，細(xì)菌的生理活動將受到重要影響，細(xì)菌的生存和定植能力均會降低。

非編碼的小RNA（noncoding small RNA，sRNA）是細(xì)菌中基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，大小為30～500 nt，是一類可進行轉(zhuǎn)錄而不翻譯為蛋白質(zhì)的RNA分子，sRNA可通過與特定的mRNA靶標(biāo)結(jié)合而對細(xì)菌功能作出調(diào)節(jié)。沙門菌中所存在的sRNA是革蘭氏陰性細(xì)菌中與伴侶蛋白Hfq（保守的RNA分子伴侶蛋白RNA-binding protein Hfq）相關(guān)性最高的小RNA之一，能與伴侶蛋白Hfq共同作用于細(xì)菌各種細(xì)胞功能如：生長增殖、糖轉(zhuǎn)運、壓力應(yīng)答、營養(yǎng)物質(zhì)吸收、毒性毒力和環(huán)境應(yīng)激等生命活動并產(chǎn)生一定的影響[6-9]。GcvB sRNA是沙門菌中1個極保守、長度為200個核苷酸的小RNA，具有廣泛且重要的調(diào)節(jié)能力，可調(diào)控沙門菌中約1%～2%的mRNA，多為氨基酸與短多肽的轉(zhuǎn)移蛋白，包括了ABC轉(zhuǎn)移蛋白家族中的Dpp蛋白和Opp蛋白[10]。目前研究可知，GcvB有3個調(diào)控區(qū)域，分別為：位于莖環(huán)SL1和SL2之間一個29 nt長的G/U豐富的單鏈序列的R1區(qū)域、位于莖環(huán)SL3和SL4之間序列為ACUUCCUGUA的R2區(qū)域及位于莖環(huán)SL4上的R3區(qū)域[11-12]。

lacZ能夠通過aphA的起始密碼子ATG進行翻譯，表達(dá)β-半乳糖苷酶[13]，本研究通過構(gòu)建aphA與lacZ的融合基因ΔaphA::lacZ，并以其為對照檢測缺失GcvB后，aphA相對轉(zhuǎn)錄量與β-半乳糖苷酶活性差異變化，研究GcvB對aphAmRNA水平與蛋白水平的調(diào)控作用，以期為sRNA的后續(xù)研究與沙門菌防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及試劑 鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2（wild type，wt）和鼠傷寒沙門菌gcvB基因缺失株（基因型ΔgcvB::cat）（人為構(gòu)建所得[14]）均由法國國家科學(xué)研究中心（Centre national de la recherche scientique，CNRS）分子遺傳學(xué)Bossi實驗室饋贈；鼠傷寒沙門菌GcvB R1基因缺失株（基因型ΔgcvBR1::cat）、鼠傷寒沙門菌GcvB R2基因缺失株（基因型ΔgcvBR2::cat）和鼠傷寒沙門菌GcvB R3基因缺失株（基因型ΔgcvBR3::cat）均由本實驗室構(gòu)建所得。

質(zhì)粒pKD46（λ red同源重組質(zhì)粒，攜帶氨芐抗性基因）、質(zhì)粒pCP21（flp重組酶，可識別frt位點）、質(zhì)粒pCE40（攜帶frt位點與lacZ基因，但lacZ無啟動子）、質(zhì)粒pKD13（攜帶frt位點，攜帶有卡那霉素抗性基因）和P22噬菌體均由CNRS分子遺傳學(xué)Bossi實驗室饋贈。

細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix ExTaqⅡ購自TaKaRa公司；pfu和TaqDNA聚合酶、ONPG購自北京索萊寶科技有限公司；QIAquick PCR Purification Kit（50）購自生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑均為分析純?？股貪舛龋喊逼S西林100 mg/mL、氯霉素 20 mg/mL、卡那霉素 50 mg/mL。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 電轉(zhuǎn)化 以質(zhì)粒pKD13作為模板，使用引物P1/P2進行PCR，擴增體系為：pKD13（1∶20）10 μL，緩沖液8 μL、ddH2O 57 μL，上、下游引物各1 μL，dNTPS Mix（2.5 mmol/L each）2 μL，Taq酶和pfu酶混合物（3∶1）1 μL；反應(yīng)程序為：95℃變性10 s，53～60℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收并純化擴增產(chǎn)物。

感受態(tài)細(xì)菌的構(gòu)建：將700 μL過夜菌株置于70 mL LBA中，加入L-阿拉伯糖培養(yǎng)菌株7455 OD600值為0.4～0.6。取菌液35 mL置于離心管中，離心后棄上清液。沉淀中加入35 mL的10%甘油，混勻后離心并棄上清液，沉淀中加入17.5 mL的10%甘油進行懸浮，再次離心后棄上清液。沉淀中加入9 mL的10%甘油，混勻后離心并棄上清液，沉淀中加入200 μL的10%甘油進行懸浮。

電轉(zhuǎn)化：取50 μL感受態(tài)細(xì)菌與5 μL純膠回收產(chǎn)物（或質(zhì)粒）在冰上混勻后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，以時間常數(shù)T為6.0、電壓為2.5進行電擊后，迅速在電轉(zhuǎn)杯中加入1 mL SOC，搖晃孵育1 h后，取100 μL電轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂至LB卡那抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆菌落進行純化培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化后的菌株。

通過以上方法，先將使用P1/P2引物擴增所得的目的片段轉(zhuǎn)入7455菌株中，通過卡那抗性平板篩選獲得菌株7455-aphA。再將pCP21質(zhì)粒轉(zhuǎn)到7455-aphA菌株中，通過LBA培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得菌株aphA-pCP21。將質(zhì)粒pCE40轉(zhuǎn)入菌株aphA-pCP21，通過抗性平板篩選既具有卡那抗性，同時又在麥康凱平板上呈紅色的鼠傷寒沙門菌株LT2ΔaphA::lacZ，通過PCR與測序驗證正確后，將其命名為ΔaphA::lacZ。

1.3 轉(zhuǎn)導(dǎo) 抽取0.3 mL過夜培養(yǎng)的供體菌菌液加入到2.3 mL P22噬菌體broth中培養(yǎng)8 h后，離心取上清液，加入少量CHCl3滅菌，獲得裂解液。

吸取100 μL過夜培養(yǎng)的受體菌菌液與50 μL供體菌裂解液（1∶50）混勻，在相應(yīng)溫度的環(huán)境中孵育后，涂布于相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，通過PCR進行驗證。

將LT2ΔaphA::lacZ作為供體菌，通過以上方式將ΔaphA::lacZ區(qū)域分別轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門菌GcvB基因缺失株（基因型ΔgcvB::cat）、鼠傷寒沙門菌GcvB R1基因缺失株（基因型ΔgcvB R1::cat）、鼠傷寒沙門菌GcvB R2基因缺失株（基因型ΔgcvB R2::cat）、鼠傷寒沙門菌GcvB R3基因缺失株（基因型ΔgcvB R3::cat）中，通過抗性平板（cat）進行篩選，分別獲得LT2ΔaphAΔgcvB::cat、LT2ΔaphA△R1::cat、LT2ΔaphA△R2::cat、LT2ΔaphA△R3::cat菌株。

1.4 β-半乳糖核苷酸實驗 對構(gòu)建的菌株進行β-半乳糖核苷酸實驗：將待測菌株置于相應(yīng)的環(huán)境中過夜培養(yǎng)，次日取100 μL過夜菌液培養(yǎng)至OD600值為0.3～0.5，取0.1 mL菌液置于試管中，以Z buffer定容至1 mL，使用巴斯德吸管加入1滴甲苯，立即旋轉(zhuǎn)振蕩30 s，置于42℃搖床中振蕩培養(yǎng)2 h，再置于28℃水浴鍋中孵育5 min。在試管中加入0.2 mL ONPG（4 mg/mL）反應(yīng)，記錄加入時間（start time，t0）。當(dāng)試管中出現(xiàn)黃色，加入0.1 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，記錄終止時間（finish time，tf）。將試管中液體離心后取上清液1 mL置于比色皿中，以Z buffer作為空白對照，測OD420，記錄數(shù)值。

1.5 qPCR試驗 根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并以此為模板進行PCR擴增，擴增體系為：上、下游引物各1 μL，2×Taq DNA Master Mix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，DNA模板4 μL。擴增條件為：95℃預(yù)變性30 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共35個循環(huán)。

將提取的相應(yīng)菌株的總RNA樣本反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板，參考SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明進行兩步法反應(yīng)。擴增條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共39個循環(huán)，每個樣本3個重復(fù)。對樣本數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算相關(guān)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，即Fold change。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化構(gòu)建菌株結(jié)果 以擬LT2ΔaphA::lacZ作為模板，采用特異性引物P3/P4對aphA基因進行擴增，將膠回收產(chǎn)物送測序。通過測序結(jié)果的峰圖與序列，確定成功構(gòu)建了沙門菌菌株LT2ΔaphA::lacZ（圖1），lacZ的序列從aphA的ATG開始39個堿基后進行替換，采用aphA ATP進行β-半乳糖甘酶蛋白的翻譯表達(dá)。

圖1 LacZ替換aphA部分Fig.1 LacZ replaces the aphA section

2.2 轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建結(jié)果 以LT2ΔaphAΔgcvB::cat、LT2ΔaphA△R1::cat、LT2ΔaphA△R2::cat、LT2ΔaphA△R3::cat為模版，使用特異性引物P3/P4進行l(wèi)acZ片段的擴增，使用特異性引物P5/P6對GcvB片段進行擴增。由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可知，PCR擴增出了相應(yīng)目的片段，確認(rèn)成功構(gòu)建出相應(yīng)的沙門菌缺失菌株。

圖2 PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR results

2.3 β-半乳糖苷酶（lacZ）酶活性測定 將菌株LT2ΔaphA::lacZ、LT2ΔaphAΔgcvB::cat、LT2ΔaphAΔR1::cat、LT2ΔaphAΔR2::cat、LT2ΔaphAΔR3::cat進行β-半乳糖苷酶（lacZ）酶活性測定試驗，結(jié)果見圖3。以ΔaphA::lacZ作為對照組（100%），試驗菌株β-半乳糖苷酶酶活均有所增加，分別為：LT2ΔaphAΔgcvB::cat（145.53%），LT2ΔaphAΔR1::cat（244.47%）、L T 2 Δa p h AΔ R 2::c a t（2 3 0.6 7%）、L T 2 Δa p h AΔ R 3::c a t（3 0 5.0 6%），除LT2ΔaphAΔgcvB::cat（145.53%）外，其余菌株變化均顯著。而相對于GcvB全缺失菌株LT2ΔaphAΔgcvB::cat，GcvB單一區(qū)域缺失的菌株LT2ΔaphAΔR1::cat、LT2ΔaphAΔR2::cat、LT2ΔaphAΔR3::cat變化均顯著。

圖3 β-半乳糖苷酶酶活測定結(jié)果Fig.3 Determination of β-galactosidase enzyme activity

2.4 缺失部分對aphA轉(zhuǎn)錄水平的影響 以菌株wt、LT2ΔgcvB::cat、LT2△R1::cat、LT2△R2::cat、LT2△R3::cat作為模版，提取相應(yīng)菌株的RNA，以特異性引物進行qPCR，結(jié)果見圖4。將wt（即沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2）作為對照組（100%），試驗菌株中的a p h A均有所下調(diào)，分別為：LT2ΔgcvB::cat（48.17%）、LT2ΔgcvB R1::cat（22.93%）、LT2ΔgcvB R2::cat（22.94%）、LT2ΔgcvB R3::cat（22.17%）。相對于全缺失GcvB菌株LT2ΔgcvB::cat，GcvB單一區(qū)域缺失的菌株LT2ΔaphAΔR1::cat、LT2ΔaphAΔR2::cat、LT2ΔaphAΔR3::cat變化極顯著。

圖4 不同缺失后的STM4351相對轉(zhuǎn)錄量Fig.4 The relative transcription of STM4351 after di ff erent deleted

3 討論

在當(dāng)前，關(guān)于sRNA調(diào)控的研究大多為大通量的分析或調(diào)控因子的研究，而根據(jù)sRNA調(diào)控的方式，以單個基因作為目標(biāo)進行分子水平研究，能使調(diào)控機理的研究更為深入具體。在革蘭氏陰性菌中，sRNA能與伴侶蛋白Hfq協(xié)同作用，將通過與靶mRNA的5'非翻譯區(qū)（5' UTR）進行不完全互補序列的堿基配對而發(fā)揮作用[15]。而sRNA對靶mRNA的調(diào)控機制主要為偶聯(lián)降解、催化降解、閉塞、激活[16]。在偶聯(lián)降解中sRNA與mRNA進行堿基配對后，sRNA與靶mRNA都被降解，mRNA的水平就出現(xiàn)下降的情況；而催化降解中，sRNA只是起催化作用，靶mRNA會被降解而sRNA則不被降解；激活則如哈維弧菌和霍亂弧菌顯示aphA mRNA受到了群體調(diào)控小RNA（Qrr sRNA）的調(diào)控，aphA mRNA約200 nt長的5' UTR會自發(fā)形成掩蓋其核糖體結(jié)合位點的抑制性結(jié)構(gòu)，不能進行B類酸性磷酸酶翻譯，而Qrr sRNAs可以通過伴侶蛋白Hfq輔助堿基配對與aphA mRNA的5' UTR直接進行堿基配對，打開抑制性結(jié)構(gòu)，暴露核糖體結(jié)合位點，與核糖體進行結(jié)合，從而激活aphA的產(chǎn)生[17-18]。在沙門菌中，翻譯會從形成由30S核糖體亞基組成的起始復(fù)合物開始，該復(fù)合物與mRNA的核糖體結(jié)合位點起始因子結(jié)合起來，隨后結(jié)合50S核糖體，形成具有翻譯活性的70S核糖體復(fù)合物。GcvB sRNA在大多數(shù)情況下，與靶基因的5' UTR進行不完全的互補序列，堿基配對干擾了30S核糖體亞基的結(jié)合，從而阻斷翻譯起始，達(dá)成對目的基因調(diào)控[19]。

如果sRNA缺失后，靶基因所翻譯的蛋白，即β-半乳糖苷酶活性出現(xiàn)顯著性變化時，會認(rèn)為sRNA能對靶基因產(chǎn)生調(diào)控作用。本研究以沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2作為對照組，當(dāng)GcvB sRNA缺失后，aphA ATG起始的β-半乳糖苷酶活性卻沒有出現(xiàn)顯著性變化，在mRNA水平上，aphA的轉(zhuǎn)錄量卻出現(xiàn)一定的下降。那么GcvB似乎并不能夠?qū)phA進行調(diào)控，但有與aphA mRNA進行結(jié)合的可能。將目前GcvB進行調(diào)控的R1、R2、R3單區(qū)分別缺失后，aphA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了降低，β-半乳糖苷酶活性上升了230%～305%。GcvB R1、R2、R3缺失顯示出了對aphA的調(diào)控作用。針對這種現(xiàn)象，推測GcvB中可能存在調(diào)控aphA的區(qū)域，在通常情況下R1、R2、R3會聯(lián)合抑制其對aphA的調(diào)控，而缺失某一片段后，抑制作用消失，呈現(xiàn)了對aphA的調(diào)控作用；也可能是因為aphA參與了沙門菌的群體感應(yīng)，GcvB能抑制或激活細(xì)菌相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)菌的穩(wěn)定，當(dāng)其缺失導(dǎo)致細(xì)菌生長環(huán)境發(fā)生變化，aphA轉(zhuǎn)錄量也出現(xiàn)了變化，而R1、R2、R3缺失能使反饋到GcvB的信號不發(fā)生作用，導(dǎo)致aphA表達(dá)量發(fā)生變化。本研究確定了GcvB與aphA的表達(dá)有一定的聯(lián)系，為進一步闡述GcvB在STM LT2中的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)，但其具體的機制還需進一步研究。

在鼠傷寒沙門菌野生型菌株LT2中，完整的GcvB能影響aphA的mRNA轉(zhuǎn)錄量，而當(dāng)GcvB sRNA中R1、R2、R3缺失后能夠?qū)phA有抑制作用。本研究為沙門菌中的sRNA后續(xù)研究及沙門菌的防治奠定了一定基礎(chǔ)。