陳路娟，程 喆，王彥海，趙利美

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，包頭014060；2.廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院寄生動(dòng)物研究室，廈門361102）

多房性包蟲病俗稱泡型包蟲?。╝lveolar echinococcosis，AE），是由多房棘球絳蟲（Echinococcus multilocularus，Em）的幼蟲感染引起的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病[1-3]。AE廣泛分布于北半球，我國(guó)是世界上包蟲病高發(fā)的國(guó)家之一，主要分布于西北和西南地區(qū)，某些牧區(qū)發(fā)病率可高達(dá)10%，內(nèi)蒙古是AE的高發(fā)地區(qū)之一[4]。泡球蚴在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)呈彌漫性浸潤(rùn)生長(zhǎng)，猶如惡性腫瘤，導(dǎo)致“類肝癌樣”致死性寄生蟲病，危害性較大。WHO相關(guān)資料顯示，未經(jīng)治療的AE患者10年病死率高達(dá)94%，因此有“惡性包蟲病”或“蟲癌”之稱[5]。

AE發(fā)病緩慢，早期癥狀不明顯，且發(fā)展迅速，至今仍無(wú)有效的預(yù)防措施。多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期，失去最佳手術(shù)治療時(shí)間，術(shù)后療效不穩(wěn)定，易復(fù)發(fā)，因此只能選擇藥物治療，而藥物治療棘球蚴病的效果并不理想，且存在多種缺陷，比如費(fèi)用昂貴、耐藥性、毒副作用等[6]。由于缺乏有效的治療和預(yù)防手段，泡型包蟲病目前尚未得到有力的控制，迫切需要安全有效的防治措施。因此，研究多房棘球絳蟲與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其致病機(jī)制，對(duì)預(yù)防和控制泡型包蟲病的流行至關(guān)重要。

鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是一種一級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守的Ca2+結(jié)合蛋白，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）滯留蛋白家族，具有N、P、C三個(gè)結(jié)構(gòu)和功能區(qū)。CRT具有多種生物學(xué)功能，比如參與鈣離子儲(chǔ)存與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡與粘附等，某些物種CRT還能夠通過與補(bǔ)體組分C1q結(jié)合，抑制C1q依賴的補(bǔ)體經(jīng)典途徑活化[7-8]。比如美洲板口線蟲（Necator americanus）CRT能與人C1q結(jié)合并抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解，同時(shí)還能特異性的結(jié)合一些整合素的胞質(zhì)信號(hào)區(qū)及白細(xì)胞和血小板相關(guān)的粘附分子[9]；捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）CRT既可結(jié)合C1q[10]，又可結(jié)合C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein）[11]，從而抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活。C反應(yīng)蛋白與C1q結(jié)合后會(huì)激活經(jīng)典途徑，而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲CRT既能結(jié)合C1q又能結(jié)合C反應(yīng)蛋白，起到了雙重抑制作用；馬來絲蟲（Brugia malayi）CRT可與C1q結(jié)合抑制補(bǔ)體的活化[12]。近年來，有關(guān)旋毛蟲（Trichinella spiralis）的研究也證實(shí)，CRT不僅能通過與C1q結(jié)合，還能作用于甘露糖結(jié)合凝集素MBL而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13-14]。

經(jīng)同源性分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，多房棘球絳蟲鈣網(wǎng)蛋白（Echinococcus multilocularus calreticulin，EmCRT）（GenBank登錄號(hào)：CUT99434.1）與美洲板口線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、馬來絲蟲、旋毛蟲CRT的同源性分別為56%、55%、49%和41%，認(rèn)為EmCRT也具有結(jié)合補(bǔ)體C1q的潛力。本研究對(duì)EmCRT基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，并對(duì)其蛋白序列進(jìn)行分析，為后續(xù)研究其逃避宿主免疫攻擊的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為抗包蟲疫苗和新藥的研制提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 蟲體與載體 多房棘球絳蟲原頭蚴由唐崇惕等[15]采自內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原，采用昆明株小鼠腹腔接種傳代，保存于廈門大學(xué)寄生動(dòng)物研究室；真核表達(dá)載體pcDNA3.3-Myc由廈門大學(xué)細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室韓家淮教授提供。

1.2 細(xì)胞 Hela細(xì)胞保存于廈門大學(xué)人獸共患寄生蟲病實(shí)驗(yàn)室。

1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；rTaq DNA聚合酶購(gòu)自加拿大ABM公司；限制性核酸內(nèi)切酶、LipofectamineTM2000 Transfection Reagent、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗均購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)GE Healthcor；Myc-Tag Rabbit抗體、抗兔二抗購(gòu)自中國(guó)Cell Signaling Techonology公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的多房棘球絳蟲鈣網(wǎng)蛋白EmCRT基因序列（GenBank登錄號(hào)：LN902845.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物F1：5'-GAGGAAAATTTTCGGATC CGCCACCATGGCCATCCTTGC-3'，下游引物R1：5'-AGCTTCCCAATTGGGGCTCGAGCAATTCATCCTTTG GG-3'，下劃線部分為酶切位點(diǎn)，加粗部分為不依賴連接反應(yīng)克隆（ligation independent cloning，LIC）序列。引物由廈門鉑瑞生物公司合成。

1.5 RNA提取與cDNA合成 將收集到的多房棘球絳蟲囊用RNAlater處理，按照總RNA提取試劑盒使用說明提取蟲體總RNA。以提取的蟲體總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明合成cDNA。

1.6 EmCRT基因的克隆 以囊cDNA為模板，對(duì)EmCRT基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（50 μL）：rTaq Mix 25 μL，ddH2O 17.5 μL，cDNA模板5 μL，上、下游引物各1.25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，純化并回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.7 重組質(zhì)粒pcDNA3.3-Myc-EmCRT的構(gòu)建 將擴(kuò)增回收產(chǎn)物與用BamHⅠ、XhoⅠ酶切處理的pcDNA3.3-Myc載體連接，反應(yīng)體系：載體90 ng，PCR回收產(chǎn)物90 ng，酶緩沖液1 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL，冰浴5 min。再加入1 μL Exo Ⅲ酶4℃反應(yīng)1 h。最后加入1 μL EDTA（0.5 mol/L，pH8.0）終止反應(yīng)，并于65℃水浴融化5 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有氨芐青霉素的平板，37℃過夜培養(yǎng)。次日挑取菌落PCR和雙酶切鑒定均正確的質(zhì)粒，送至廈門鉑瑞生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 重組蛋白的表達(dá)與鑒定 Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前接種合適密度的Hela細(xì)胞至6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%匯合時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說明DNA（μg）：脂質(zhì)體（μL）為1∶2的比例轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后收集蛋白。

Western blot檢測(cè)EmCRT蛋白的表達(dá)：將目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，以兔源Myc標(biāo)簽單克隆抗體為一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行雜交，最后用ECL顯色。

重組蛋白的免疫熒光檢測(cè)：將L-多聚賴氨酸包被的細(xì)胞爬片置于12孔板內(nèi)，加入轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，密度為2×105個(gè)/孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合時(shí)，吸去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛進(jìn)行固定，再用10%山羊血清室溫封閉2 h，用抗Myc單克隆抗體及Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗進(jìn)行雜交，最后在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 EmCRT蛋白序列分析 利用在線軟件SignalP 4.1 Server對(duì)EmCRT進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，運(yùn)用ClustalW軟件將多房棘球絳蟲鈣網(wǎng)蛋白EmCRT與其他寄生蟲（美洲板口線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、馬來絲蟲）CRT進(jìn)行同源性比對(duì)分析；參照捻轉(zhuǎn)血矛線蟲CRT的C1q結(jié)合位點(diǎn)，尋找EmCRT的C1q潛在結(jié)合區(qū)域[9]。

2 結(jié)果

2.1 EmCRT基因的擴(kuò)增 提取多房棘球絳蟲囊總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用特異引物對(duì)EmCRT基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1200 bp處可見明顯條帶（圖1），與預(yù)期目的基因片段長(zhǎng)度一致。

圖1 EmCRT基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of EmCRT

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.3-Myc-EmCRT的篩選和鑒定將PCR產(chǎn)物連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.3-Myc上獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.3-Myc-EmCRT，將其轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，其中1～5號(hào)菌落在1200 bp處有明顯的陽(yáng)性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2A）。

挑取PCR鑒定正確的菌落，接種培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到大小分別約為5100 bp和1200 bp的兩個(gè)核酸片段（圖2B），與預(yù)期大小一致。測(cè)序結(jié)果與EmCRT基因（GenBank登錄號(hào)：LN902845.1）序列一致性達(dá)100%。

圖2 重組質(zhì)粒菌落PCR和雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmids by PCR and restriction enzyme

2.3 pcDNA3.3-Myc-EmCRT重組質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中的表達(dá) 于轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，抽提細(xì)胞蛋白，取部分上清液，以Myc單克隆抗體為一抗，對(duì)重組蛋白EmCRT進(jìn)行Western blot識(shí)別。結(jié)果顯示，在約46 kDa處有特異性表達(dá)條帶（圖3A），與目的基因編碼的蛋白理論值大小相符（含載體攜帶的標(biāo)簽），表明重組蛋白EmCRT在Hela細(xì)胞中得到了表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.3-Myc-EmCRT的細(xì)胞帶有綠色熒光，而對(duì)照組未轉(zhuǎn)染細(xì)胞未見明顯熒光（圖3B）。

圖3 重組EmCRT蛋白的表達(dá)與鑒定Fig.3 Western blot and cell immuno fluorescence analysis of recombinant EmCRT

2.4 EmCRT序列分析 利用軟件SignalP 4.1對(duì)EmCRT進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白N端的第1-18位氨基酸為信號(hào)肽序列（圖4A）。

經(jīng)過同源性序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)多房棘球絳蟲鈣網(wǎng)蛋白EmCRT與美洲板口線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和馬來絲蟲鈣網(wǎng)蛋白的氨基酸序列同源性高達(dá)49%～56%（圖4B）。進(jìn)一步對(duì)比其他蠕蟲鈣網(wǎng)蛋白序列，發(fā)現(xiàn)多房棘球絳蟲鈣網(wǎng)蛋白EmCRT具有4個(gè)C1q潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖4C）。

圖4 EmCRT序列分析Fig.4 Sequence analysis of EmCRT

3 討論

包蟲病是一種嚴(yán)重影響人民健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人獸共患寄生蟲病，特別是AE，病死率較高，但缺乏安全有效的防治手段。根據(jù)我國(guó)實(shí)際情況，采取以免疫預(yù)防為主的防治措施是較理想的途徑[16]。因而探究多房棘球絳蟲的致病機(jī)制，特別是蟲體逃避宿主免疫攻擊的機(jī)制，對(duì)于AE的防控具有重要作用。

逃避宿主的免疫攻擊是寄生蟲在宿主體內(nèi)存活的關(guān)鍵因素，因此在自然界長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，寄生蟲為了能夠在宿主體內(nèi)存活，形成了一套復(fù)雜的逃避宿主免疫攻擊的能力，稱為免疫逃避。主要包括：（1）解剖位置的隔離：有些寄生蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)或腔道中形成囊壁、包囊或納蟲空泡等生理屏障，使之與宿主免疫系統(tǒng)隔離；（2）表面抗原的改變：寄生蟲在不同發(fā)育階段不斷產(chǎn)生新的抗原變異體，造成宿主產(chǎn)生的特異性抗體無(wú)法對(duì)其進(jìn)行識(shí)別即抗原變異；有些寄生蟲體表可表達(dá)與宿主組織相似的成分即分子模擬，或?qū)⑺拗骺乖降较x體體表，或用宿主抗原將自身包被，偽裝了蟲體本身，即抗原偽裝，從而保護(hù)蟲體不受免疫攻擊；（3）破壞或抑制宿主免疫應(yīng)答：主要表現(xiàn)在蟲體對(duì)特異性B淋巴細(xì)胞的耗竭、對(duì)Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)與激活以及對(duì)補(bǔ)體的逃避等[17]。

補(bǔ)體系統(tǒng)作為固有免疫的一部分，是抵御病原體入侵宿主的重要防線，在機(jī)體抗感染免疫過程中具有重要作用，因此逃避宿主的補(bǔ)體攻擊成為病原體實(shí)施免疫逃避策略過程中的首要靶標(biāo)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）脂蛋白BBK32可通過作用于補(bǔ)體組分C1而抑制經(jīng)典途徑的活化[19]；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的堿性蛋白酶可通過裂解補(bǔ)體C2而抑制經(jīng)典途徑和MBL途徑的激活[20]；白色念珠菌（Candida albicans）pH調(diào)節(jié)抗原Pra1可通過裂解補(bǔ)體C3而抑制三條補(bǔ)體途徑的活化[21]；旋毛蟲副肌球蛋白Ts-Pmy可與補(bǔ)體C1q和C9結(jié)合而抑制補(bǔ)體的活化[22-23]。上個(gè)世紀(jì)70年代，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)多房棘球絳蟲幼蟲可通過經(jīng)典途徑或旁路途徑激活補(bǔ)體[24]，因此逃避補(bǔ)體系統(tǒng)的殺傷對(duì)于多房棘球絳蟲在中間宿主體內(nèi)的生存具有極其重要的影響，但其逃避補(bǔ)體攻擊的具體分子機(jī)制至今尚不清楚[25]。

鈣網(wǎng)蛋白是一種高度保守的Ca2+結(jié)合蛋白，具有多種生物學(xué)功能[26-27]。序列比對(duì)顯示EmCRT與其他寄生蟲CRT具有49%～56%的同源性，表明這些CRT對(duì)于蟲體在宿主體內(nèi)的存活起到相對(duì)保守的作用。根據(jù)報(bào)道，寄生蟲CRT一般作為一種分泌性蛋白或表達(dá)于蟲體體表，通過與補(bǔ)體經(jīng)典途徑啟動(dòng)因子C1q結(jié)合而參與宿主的免疫調(diào)節(jié)作用[9,10,13]。由此我們推測(cè)，多房棘球絳蟲感染宿主后其CRT可能也具有免疫調(diào)節(jié)的作用，因而對(duì)其相關(guān)特性及功能開展研究。

外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，其中最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌（E.coli）表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，每一類表達(dá)系統(tǒng)都具有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有指導(dǎo)蛋白正確折疊、多種翻譯后修飾功能等優(yōu)點(diǎn)[28]，表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能等方面接近天然蛋白質(zhì)分子[29]。pcDNA系列載體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白常用的體系之一，具有巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）強(qiáng)啟動(dòng)子，可操縱外源基因在多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)。本研究應(yīng)用PCR法成功克隆多房棘球絳蟲囊EmCRT基因，經(jīng)測(cè)序證實(shí)其與GenBank公布的EmCRT序列一致。運(yùn)用基因重組技術(shù)將EmCRT基因片段插入真核表達(dá)載體pcDNA3.3-Myc，構(gòu)建了pcDNA3.3-Myc-EmCRT重組質(zhì)粒。選用pcDNA3.3作為表達(dá)載體，表達(dá)產(chǎn)生的重組蛋白N末端具有Myc標(biāo)簽的融合蛋白，易于蛋白的純化和檢測(cè)。采用新一代脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，Western blot及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)到EmCRT的表達(dá)，表明重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中正確表達(dá)。

應(yīng)用SignalP 4.1軟件對(duì)EmCRT蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其N端1～18 aa為信號(hào)肽序列，為了不影響蛋白的分泌，在設(shè)計(jì)真核表達(dá)的引物時(shí)保留了信號(hào)肽。根據(jù)以上分析，推測(cè)該蛋白為多房棘球絳蟲的1種分泌蛋白。通過進(jìn)一步序列比對(duì)分析，參比捻轉(zhuǎn)血矛線蟲CRT蛋白序列發(fā)現(xiàn)EmCRT至少具有4個(gè)潛在的C1q結(jié)合位點(diǎn)，這對(duì)后續(xù)EmCRT與人補(bǔ)體組分相互作用的研究具有重要參考價(jià)值，但預(yù)測(cè)分析獲得的結(jié)果尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確證。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將在此預(yù)測(cè)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上探究EmCRT與人補(bǔ)體C1q的相互作用，并進(jìn)一步研究二者的結(jié)合是否會(huì)影響C1q介導(dǎo)的補(bǔ)體及非補(bǔ)體活化功能，從而深入闡明多房棘球絳蟲逃避宿主補(bǔ)體攻擊的分子機(jī)制。