高曉龍，王英超，李 月，沈光年，劉曉冬，周德剛，梅 力，馮小宇

（1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心，北京102600；2.北京市獸藥監(jiān)察所，北京102629）

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病。其在家豬和野豬中廣泛傳播，嚴(yán)重威脅豬養(yǎng)殖業(yè)，被世界動物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health，OIE）列入OIE疫病名目[1]，為必須申報的法定傳染病，也是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的一類傳染病[2]。

近年來，我國豬瘟病毒的感染病例多呈現(xiàn)非典型性臨床癥狀和病理剖檢變化，其典型特征與當(dāng)下我國廣泛流行的非洲豬瘟極其相似，表現(xiàn)為發(fā)熱、全身廣泛性小點出血、便秘腹瀉、脾梗死等。因此，必須通過實驗室診斷進(jìn)行鑒別。目前已有的檢測方法包括ELISA、普通PCR、實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[3]、重組酶擴(kuò)增酶檢測技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）[4]等，但以上方法均存在靈敏度不夠，出現(xiàn)假陽性或假陰性的情況。

數(shù)字PCR( digital PCR，dPCR）屬于第3代PCR，最早出現(xiàn)于1999年[5]，其中微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)是近年來廣泛用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量的核酸檢測技術(shù)。與傳統(tǒng)的qPCR相比，ddPCR通過統(tǒng)計學(xué)原理直接給出濃度，其結(jié)果不再依賴于Ct值[6]，避免了在低拷貝數(shù)、細(xì)微模板濃度差異中靈敏度和精確度的缺陷，能夠?qū)崿F(xiàn)絕對定量。Yan等[7]采集了10個感染H7N9的患者不同治療時期的樣本，分別進(jìn)行qPCR及ddPCR檢測，發(fā)現(xiàn)對于qPCR陰性的樣本，ddPCR仍可以檢測出病毒的存在，說明ddPCR的靈敏度遠(yuǎn)高于qPCR。ddPCR不僅可以對病原體定性，而且還能對病原體DNA或RNA序列進(jìn)行絕對定量，從而對疾病進(jìn)行早期診斷、藥物療效觀察、病情判斷及預(yù)后觀察，目前dPCR技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）、艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、甲型流感病毒等臨床領(lǐng)域[8]。

本研究建立并優(yōu)化了豬瘟病毒微滴式數(shù)字PCR的絕對定量方法，為豬瘟病毒的早期診斷、實時監(jiān)測和科學(xué)研究提供了一種新的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品和臨床樣品 豬瘟病毒C株（CSFV C株）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）JXA1株、LV株，圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus virus 2，PCV2），偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV），豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus virus，PPV），豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV）均由北京市動物疫病預(yù)防控制中心保存；50份臨床樣品中，豬全血樣品18份、豬組織樣品32份，均由北京市動物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.2 試劑 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes、Droplet Generation Oil for Probe購自伯樂公司；AMV酶、SuperScriptTMⅢ酶購自北京全式金公司；豬瘟病毒（CSFV）通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒購自世紀(jì)元亨公司；引物探針由英濰捷基有限公司合成。

1.3 引物探針設(shè)計 根據(jù)CSFV 5' UTR基因保守區(qū)，分別在首部、中部、尾部設(shè)計了3套引物探針（表1），探針5'端標(biāo)記FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1熒光淬滅基團(tuán)。從中篩選出通用性好，拷貝數(shù)高的引物探針。

表1 本研究中使用的引物探針Table 1 Primers and probes used in this study

1.5 病毒核酸提取 根據(jù)病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取核酸，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ddPCR方法的建立 通過對反轉(zhuǎn)錄條件、PCR條件的優(yōu)化，建立ddPCR方法，并對該方法的線性及最低檢測限進(jìn)行測定。反轉(zhuǎn)錄酶可選擇AMV酶、SuperScriptTMⅢ酶、One-Step RT-ddPCR Kit for Probes試劑盒中Reverse transcriptase。引物濃度設(shè)置為600 nmol/L、900 nmol/L、1200 nmol/L，探針濃度設(shè)置為150 nmol/L、250 nmol/L、350 nmol/L，退火溫度設(shè)置為55℃、57℃、60℃、62℃。反應(yīng)體系為：One-step ddPCR supermix 5 μL，Reverse transcriptase 2 μL，300 mmol/L DTT 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.8 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，ddH2O 7.7 μL，模板2 μL。擴(kuò)增條件為50℃ 20 min；95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃～62℃1 min，40個循環(huán)；4℃ 60 min。

1.7 靈敏性試驗 為評估所建立的CSFV ddPCR檢測方法的線性關(guān)系、擴(kuò)增效率、靈敏性，將豬瘟病毒（CSFV C株）標(biāo)準(zhǔn)毒株的核酸，10倍倍比稀釋（100～104），進(jìn)行ddPCR檢測，每個濃度做3個重復(fù)。

1.8 特異性試驗 提取PRRSV JXA1、PRRSV LV、PCV2、PRV、PPV、PEDV和TGEV 7種病毒的核酸，使用已經(jīng)優(yōu)化的CSFV ddPCR方法分別對其進(jìn)行檢測。

1.9 重復(fù)性試驗 使用所建立的CSFV ddPCR對同1份樣品重復(fù)測定10次，確定方法的重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測 使用已經(jīng)優(yōu)化的CSFV ddPCR方法和qPCR方法（GB/T 27540-2011）分別對50份臨床組織樣品進(jìn)行檢測，比較檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 引物探針選擇 根據(jù)伯樂公司One-Step RT-ddPCR Kit for Probes試劑盒操作說明中ddPCR反應(yīng)體系，開展CSFV不同引物探針的ddPCR試驗，確定CSFV ddPCR方法的引物探針（圖1）。上游引物F：5'-GTCAGTAGTTCGACGTGAGCA-3'，下游引物R：5'-AGCACCCTATCAGGTCGTAC-3'，探針P：5'-FAM-ATGCCCAAGACACACCTTAACCCTRGCBHQ-3'。

圖1 CSFV ddPCR引物探針選擇Fig.1 Primers and probes of CSFV for droplet digital PCR

2.2 ddPCR方法的建立 確定反轉(zhuǎn)錄酶為One-Step RT-ddPCR Kit for Probes中的Reverse transcriptase（圖2A），引物終濃度為900 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L（圖2B），退火溫度為55℃（圖2C）。

圖2 CSFV ddPCR條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of CSFV droplet digital PCR

2.3 ddPCR靈敏性試驗 對豬瘟病毒（CSFV C株）標(biāo)準(zhǔn)毒株的核酸10倍倍比稀釋（100～104）后進(jìn)行ddPCR檢測，獲得微滴生成圖（圖3）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。CSFV ddPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-1.0766x+4.3965，R2=0.9989，線性關(guān)系良好。當(dāng)檢測濃度低于10拷貝以下時能穩(wěn)定檢出且CV值為5.91%，當(dāng)檢測濃度低于1 copy/μL時，也能穩(wěn)定性檢測出，最終確定該方法最低檢測下限為3.2 copies/μL。

圖3 CSFV ddPCR梯度稀釋微滴生成圖Fig.3 Droplet generation plot of gradient dilution for CSFV droplet digital PCR

圖4 CSFV ddPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard carve for CSFV droplet digital PCR

2.4 ddPCR特異性試驗 通過優(yōu)化后的 CSFV ddPCR檢測方法檢測其他7種病毒。結(jié)果表明ddPCR擴(kuò)增的微滴數(shù)均在10 000以上，試驗成立。僅有CSFV孔出現(xiàn)陽性微滴，其余各孔均為陰性微滴（圖5）。

圖5 CSFV ddPCR 特異性試驗Fig.5 Specificity experiment for CSFV droplet digital PCR

2.5 ddPCR重復(fù)性試驗 同1份樣品用ddPCR重復(fù)檢測10次（圖6），變異系數(shù)為3.9 %（表2）。表明所建立的CSFV ddPCR檢測方法重復(fù)性良好。

表2 CSFV ddPCR重復(fù)性試驗數(shù)據(jù)Table 2 Data of repeatability experiment for CSFV droplet digital PCR

圖6 CSFV ddPCR重復(fù)性實驗結(jié)果Fig.6 Repeatability experiment for CSFV droplet digital PCR

2.6 臨床樣品檢測 應(yīng)用本試驗建立的CSFV ddPCR方法和CSFV qPCR方法（GB/T 27540-2011）分別對50份臨床樣品（豬全血樣品18份、豬組織樣品32份）進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，采用CSFV ddPCR方法檢出陽性樣品8份，陰性樣品42份，與采用CSFV qPCR方法檢測結(jié)果一致，結(jié)果符合率為100%。

表3 臨床樣品檢測結(jié)果Table 3 Detection result of field samples

3 討論

隨著防疫技術(shù)和檢測手段的發(fā)展，多數(shù)國家已經(jīng)徹底消滅了豬瘟病毒，但是在我國豬瘟病毒仍然存在。目前在豬瘟防治過程中，豬瘟兔化弱毒疫苗起關(guān)鍵的作用，但在強(qiáng)制免疫的情況下，豬瘟病毒感染的情況仍舊存在。目前，豬瘟在臨床上多表現(xiàn)為亞急性、非典型性感染，使得豬瘟病毒早期診斷難以進(jìn)行，對于病毒載量較低的病例，傳統(tǒng)的實驗室診斷方法難以判斷，因此，建立高靈敏度的核酸檢測方法對豬瘟病毒的診斷具有重要意義。

在豬瘟病毒核酸檢測技術(shù)的早期研究中，姚俊[9]建立的豬瘟病毒TaqMan實時熒光定量 PCR方法的檢測靈敏度為1×102copies/μL，岳峰等[10]建立的TaqMan實時熒光定量PCR的最低檢測限是10 copies/μL，高飛等[11]建立的基于TaqMan探針的豬瘟病毒熒光定量PCR檢測方法的最低檢測限亦是10 copies/μL。本研究建立的微滴式數(shù)字PCR的最低檢測限為3.2 copies/μL，其靈敏度可達(dá)到單拷貝。靈敏度也稱為分辨率，對目標(biāo)基因或突變均有識別能力。該方法在讀取結(jié)果時僅判斷陽性或陰性，受擴(kuò)增效率的影響降低，對背景序列和抑制物的耐受能力提高，不依賴檢測的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對定量[12]。

本研究通過對已知的臨床樣品進(jìn)行檢測，其結(jié)果和實時熒光定量PCR方法的檢測結(jié)果完全一致，實現(xiàn)了對病毒濃度較低或需要絕對定量樣品的檢測。同時也為豬瘟中長期的防控監(jiān)測和流行病學(xué)研究提供了更加精準(zhǔn)科學(xué)的方案。