吳 倩，張建華，郝永清

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

牛傳染性鼻氣管炎（bovine infectious rhinotracheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Bovine infectious rhinotracheitis virus，IBRV）引起的接觸性傳染病，給我國(guó)的規(guī)模化養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)嚴(yán)峻的考驗(yàn)。Liess等[1-2]報(bào)道IBRV第一次于聯(lián)邦德國(guó)分離得到，并且由其引起的IBR在歐美牛群中廣泛存在。一般講，IBR分急性和慢性病例，病的后期往往難以分離出病毒。另外，慢性病例如有細(xì)菌性并發(fā)感染，易于誘發(fā)肺膿腫病。還有些病牛癥狀似牛惡性卡他熱（bovine malignant catarrhal fever，BMC），其病原是牛皰疹病毒，這就需要用檢測(cè)特異性抗體和分離病毒的方法來(lái)確診[3-4]。IBRV是一種具有囊膜結(jié)構(gòu)的雙股DNA病毒，且以糖蛋白形式存在于囊膜表面或囊膜內(nèi)。gE蛋白攜帶著某些蛋白質(zhì)代謝去向信息，在細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳遞中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)gE糖蛋白還是非常重要的免疫原，在某些病毒粒子中可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。gE基因是生物體內(nèi)外復(fù)制的非必需糖蛋白，缺少該基因不會(huì)影響病毒在體內(nèi)的復(fù)制能力。gE基因全長(zhǎng)為1700 bp，共編碼566個(gè)氨基酸[5-6]。本研究對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒gE基因的原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原建立了gE-ELISA檢測(cè)方法，為進(jìn)一步對(duì)牛傳染性鼻氣管炎的鑒別診斷和防控提供了重要技術(shù)支持[7]。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清與載體 IBRV NMHS-1毒株、pCold-TF質(zhì)粒由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存；IBRV標(biāo)準(zhǔn)牛陰性血清、陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.2 菌種與試劑 E.coli Top10、E.coli Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、Trans2000 DNA marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Axygen公司；Invitrogen Platinum SuperFi DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo公司；HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG-HRP購(gòu)自Abcam；Ni-IDA蛋白純化試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；顯色液購(gòu)自索萊寶生物公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)DNAStar對(duì)IBRV gE基因序列（GenBank登錄號(hào)：Query-227553）進(jìn)行抗原區(qū)、親水區(qū)及表面展示概率分析，并結(jié)合pCold-TF原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)的序列，利用Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，在引物的5'端加入Kpn I、EcoR I酶切位點(diǎn)。gE-F：5'-CGGGGTACCAT GACCCCGGGCTCGGCTTCGGT-3'，gE-R：5'-CCG GAATTCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCTGGTT CCCTCTCCTCGT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500 bp。

1.4 IBRV基因組的提取、PCR擴(kuò)增 按照DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取IBRV病毒基因組DNA，以此為模板，PCR法擴(kuò)增gE基因序列，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，63℃退火30s，72℃延伸90s；72℃再延伸7 min。結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果并進(jìn)行膠回收。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF-gE的構(gòu)建及鑒定 將膠回收純化的目的片段與pCold-TF質(zhì)粒用EcoR I、Kpn I于37℃雙酶切2 h，取5 μL酶切產(chǎn)物電泳鑒定，并將目的片段與pCold-TF載體連接并轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑取陽(yáng)性重組質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序。

1.6 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌Transetta(DE3)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)6 h。收集上清液和沉淀，經(jīng)12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳可溶性分析，然后用Ni-NTA親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。并用SDS-PAGE電泳分析純化效果，獲得的重組蛋白命名為rpCold-TF-gE。

1.7 重組蛋白Western blot鑒定 將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含有5%脫脂乳TBST溶液4℃條件封閉過(guò)夜。次日取出PVDF膜用TBST洗液洗滌5遍，用一抗稀釋液稀釋IBRV陽(yáng)性血清（1∶100）作為一抗，恒溫孵育1 h，用TBST洗液洗滌5遍后，加入HRP標(biāo)記兔抗牛IgG（1∶3000）恒溫孵育1 h，用TBST洗液洗滌5遍，最后用DAB顯色液，曝光拍照。

1.8 重組蛋白rpCold-TF-gE標(biāo)簽的分離及純化 將重組蛋白rpCold-TF-gE用HRV-3C蛋白酶切TF標(biāo)簽，得到單一的rgE蛋白，4℃酶切過(guò)夜，SDS-PAGE電泳分析酶切效果，純化并回收目的片段，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 兔多克隆抗體血清制備、純化及鑒定 取純化蛋白rgE按1∶1比例加入弗氏完全佐劑，用磁力攪拌器乳化至呈油包水狀態(tài)后，于臀部肌肉注射1只2.0 kg左右的大白兔，每次免疫間隔一周，共計(jì)免疫3次。于免疫后28 d心臟采血，間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，達(dá)到免疫要求后，離心收集上清液，-80℃分裝保存?zhèn)溆?。按照抗血清試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行上清液純化，取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.10 rgE-ELISA最佳工作條件的確定

1.10.1 正交篩選法選擇抗原和血清的工作濃度 用包被液將純化的重組蛋白分別按照0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL包被96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，一抗牛IBRV陽(yáng)性血清和陰性血清分別按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀釋。以兔抗牛IgG-HRP（1∶5000）為二抗，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，以10%BSA作為封閉液，確定最佳封閉條件及酶標(biāo)二抗最佳工作濃度。每孔100 μL加入TMB顯色液，室溫放置10 min，然后加入50 μL 2 mmol/L H2SO4中止反應(yīng)，在酶標(biāo)檢測(cè)儀上讀出OD450值，根據(jù)P/N值確定最佳反應(yīng)條件。

1.10.2 臨界值確定 經(jīng)上述條件的優(yōu)化，取60份陰性血清，根據(jù)OD450值計(jì)算平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)偏差3SD，并確定ELISA待檢陰性血清、陽(yáng)性血清判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.10.3 特異性試驗(yàn) 按照優(yōu)化好的條件包被ELISA酶標(biāo)板，分別對(duì)IBRV標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、陽(yáng)性血清、口蹄疫、牛病毒性腹瀉、副結(jié)核、布氏桿菌、牛支原體等陽(yáng)性血清進(jìn)行g(shù)E-ELISA方法檢測(cè)，判定其特異性。

1.10.4 敏感性試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化將IBRV陽(yáng)性血清做1∶2梯度稀釋，確定ELISA的敏感性。

1.10.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按上述優(yōu)化的條件，用同一批純化抗原包被酶標(biāo)板，并對(duì)5份IBRV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)血清設(shè)置5個(gè)重復(fù)，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)；同時(shí)采用不同批次的純化抗原包被板，進(jìn)行5次組間重復(fù)試驗(yàn)，通過(guò)公式計(jì)算變異系數(shù)。

1.10.6 臨床樣品的檢測(cè) 采用建立的gE-ELISA方法對(duì)200份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用IDEXX (IBR)抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)200份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算兩者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 gE基因PCR擴(kuò)增 以提取IBRV基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出gE基因后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，在500 bp處可見(jiàn)1條特異性條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 gE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of gE gene PCR products

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒pCold-TF-gE用EcoR I、Kpn I雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果可見(jiàn)1條約為500 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant plasmids

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化鑒定 收集誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)超聲波破碎儀裂解重組菌體，離心后分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，上清液和包涵體在70 kDa處均出現(xiàn)融合性目的條帶，而pCold-TF空載體誘導(dǎo)后無(wú)特異條帶（圖3）。使用Ni-IDA蛋白純化試劑盒純化表達(dá)產(chǎn)物上清液，獲得可融性目的條帶，分子量約為70 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符，表明誘導(dǎo)表達(dá)成功，獲得的重組蛋白命名為rpCold-TF-gE，見(jiàn)圖4。

圖3 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE鑒定重組蛋白rpCold-TF-gEFig.3 SDS-PAGE identification recombinant protein rgE IPTG induced expression

圖4 純化后的重組蛋白rpCold-TF-gE SDS-PAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE identification of purified recombinant protein rpCold-TF-gE

2.4 重組蛋白Western blot檢測(cè) rpCold-TF-gE重組蛋白純化后經(jīng)Western blot分析，結(jié)果顯示，在70 kDa位置出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，說(shuō)明重組蛋白rpCold-TF-gE在大腸桿菌中獲得正確表達(dá)并且能被IBRV陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，表明表達(dá)的重組蛋白具有很好的反應(yīng)原性（圖5）。

圖5 純化后的重組蛋白rpCold-TF-gE Western blot 鑒定Fig. 5 Western blot identification of purified recombinant protein rpCold-TF-gE

2.5 rgE重組蛋白標(biāo)簽的分離及純化 由于rpCold-TF-gE融合蛋白標(biāo)簽 TF（54 kDa 左右）相對(duì)目的蛋白（14 kDa左右）較大，用蛋白酶純化試劑盒將TF蛋白與gE蛋白分開(kāi)，并純化得到無(wú)TF標(biāo)簽的重組目的蛋白rgE（14 kDa)，SDS-PAGE 電泳分析可見(jiàn)，有單一的目的蛋白出現(xiàn)，分子量大小為14 kDa（圖6）。

圖6 重組蛋白rpCold-TF-gE標(biāo)簽的分離及純化Fig.6 Separation and purification of recombinant protein label

2.6 兔多克隆抗體血清效價(jià)、純化及鑒定 抗血清效價(jià)測(cè)定，通過(guò)IBRV全病毒蛋白以2 μg/mL的包被量建立間接ELISA方法對(duì)多克隆抗體血清效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：家兔的血清抗體效價(jià)均能達(dá)到2.0×1011；用血清純化試劑盒純化多克隆抗體血清，獲得了較高純度的兔多克隆抗體血清，其中l(wèi)gG分子結(jié)構(gòu)重鏈為55 kDa，輕鏈為25 kDa（圖7）。

圖7 SDS-PAGE 鑒定兔多克隆抗體血清Fig. 7 Identification of rabbit polyclonal antiserum by SDS-PAGE

2.7 gE-ELISA工作條件的確定

2.7.1 一抗稀釋度及抗原包被量的確定 方陣實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)抗原包被最佳稀釋倍數(shù)為1∶1000即濃度為1 μg/mL，待檢血清以1∶50稀釋時(shí)，P/N值最大，結(jié)合陰陽(yáng)性血清OD450值，確定抗原最佳包被濃度為1 μg/mL，一抗血清最佳稀釋度為1∶50。

2.7.2 ELISA 陰陽(yáng)性臨界值的確定 通過(guò)以上條件的優(yōu)化，對(duì)60份陰性血清經(jīng)IDEXX (IBR) 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，其OD450值為0.255，則臨界值為0.038，即當(dāng)樣本OD450＞X＋3SD時(shí)判為陽(yáng)性，反之為陰性。

2.7.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 按照上述優(yōu)化條件，分別對(duì)口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、副結(jié)核分歧桿菌、布魯菌、支原體等牛陽(yáng)性血清進(jìn)行g(shù)E-ELISA檢測(cè)，同時(shí)設(shè)IBRV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性對(duì)照。結(jié)果顯示為陰性，表明建立的 ELISA 方法特異性較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of specific test

2.7.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將IBRV陽(yáng)性血清做1∶2梯度稀釋，將血清稀釋至1∶4096時(shí)仍可判斷為陽(yáng)性，表明建立的方法具有較高的敏感性，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Sensitivity test results

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)5份牛IBRV陽(yáng)性血清進(jìn)行間接ELISA 檢測(cè)，組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，組內(nèi)、組間的變異系數(shù)均小于5%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.7.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 利用建立好的gE-ELISA方法對(duì)200份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，gEELISA方法檢出陽(yáng)性血清170份、陰性血清31份；利用IDEXX（IBR）抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)200份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出陽(yáng)性血清 180份，陰性血清20份，共同檢出陽(yáng)性血清170份，陰性血清20份，兩種方法的符合率為95%。

3 討論

IBRV的gE糖蛋白與其他牛皰疹病毒gE糖蛋白比較可知，組成的二硫鍵5個(gè)半光氨基酸堿基骨架高度保守且免疫原性和抗原性較高。在生物功能方面，gE蛋白作為中和抗體的主要靶位，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并且可高水平表達(dá)，適合作為抗原標(biāo)記[8]。

目前我國(guó)各地牛場(chǎng)中牛IBRV血清感染率普遍較高。在鑒別診斷上有疫苗和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，有研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于gE基因缺失疫苗，可區(qū)分自然感染牛和疫苗免疫牛，同時(shí)能夠有效地保護(hù)牛從而使本病的發(fā)生概率降到最低，此疫苗主要針對(duì)gK、TK、gE基因等進(jìn)行缺失，目前國(guó)內(nèi)并無(wú)該基因缺失疫苗上市使用[9-10]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)較傳統(tǒng)疫苗和基因缺失疫苗成本低廉而且可以大批量的檢測(cè)臨床血清，特異性好，敏感性強(qiáng)，為IBRV檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Reproducibility test results

牛傳染性鼻氣管炎的防控技術(shù)首先是靈敏高特異性強(qiáng)。利用全菌蛋白包被板建立的ELISA較易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果和與其他血清出現(xiàn)交叉反應(yīng)。本研究根據(jù)跨膜結(jié)構(gòu)域分析、蛋白抗原性、親水性、表面性分析，選擇建立以gE基因原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原，用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為一抗，并用HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG為二抗的gE-ELISA檢測(cè)方法。血清稀釋1∶4096時(shí)仍可判斷為陽(yáng)性，表明該方法有較高的敏感性。該方法只對(duì)牛陽(yáng)性血清有反應(yīng)，與其他血清無(wú)反應(yīng)，表明該方法特異性強(qiáng)。較PCR檢測(cè)方法，該方法成本低廉檢測(cè)樣本量大。通過(guò)對(duì)臨床血清樣品進(jìn)行初步檢測(cè)，與IDEXX（IBR）抗體檢測(cè)試劑盒相比，本研究建立的方法孵育時(shí)間較長(zhǎng)，有待進(jìn)一步的改善，以期達(dá)到治療和控制該病的發(fā)生并減少經(jīng)濟(jì)損失[11]。

本研究在國(guó)內(nèi)首次以gE基因原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原建立gE-ELISA檢測(cè)方法，可用于牛傳染性鼻氣管炎病毒血清抗體的檢測(cè)。本研究制備的兔多克隆抗體血清為后續(xù)的雙抗夾心法檢測(cè)抗原提供了可靠的方法和技術(shù)支持。本研究建立的方法適合大規(guī)模高通量的檢測(cè)，對(duì)自然感染及鑒別診斷和進(jìn)出國(guó)際貿(mào)易檢疫工作具有積極意義[12]。