韓冬梅，阮可悅，曹云雷，張麗榮，童 武，李國新，鄭 浩,，童光志,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.揚州大學(xué) 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009）

長期以來，基因缺失突變株的構(gòu)建是研究皰疹病毒功能基因的主要策略。1997年，Messerle等[1]首次將細菌人工染色體（BAC）應(yīng)用于皰疹病毒，成功構(gòu)建了巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）感染性細菌人工染色體克隆。該技術(shù)已成為皰疹病毒分子病原學(xué)、基因功能研究不可或缺的工具。本研究在偽狂犬病病毒變異毒株JS-2012的感染性克隆pBAC-JS2012及突變篩選菌株SW102-PRVBAC基礎(chǔ)上進行IE180啟動子的缺失[2]。

偽狂犬?。╬seudorabies, PR或Aujeszky’s disease，AD）是一種由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的多種家畜和野生動物共患的急性傳染病。豬是偽狂犬病病毒的唯一宿主，豬偽狂犬病的暴發(fā)和流行給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3-4]。PRV基因組全長約145 Kb，GC含量高達74%左右，包含70多種基因，可編碼100多種蛋白，值得注意的是PRV與其他皰疹病毒相比只有一個立即早期基因即IE180與單純皰疹病毒ICP4基因同源，其在基因組中存在兩個拷貝，且大部分序列與病毒潛伏感染相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（large latency transcripts，LLT）重疊，是病毒復(fù)制和早期基因轉(zhuǎn)錄所必需的。

根據(jù)PRV感染后基因轉(zhuǎn)錄的時間順序可將其分為三類：立即早期基因（immediate-early gene，IE）、早期基因（early gene，E）、晚期基因（late gene，L）。IE基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在病毒DNA復(fù)制之前。IE基因轉(zhuǎn)錄后，激活早期基因和晚期基因的表達，引起病毒裂解性感染。IE180是PRV唯一的一個立即早期基因，它的表達不需要任何病毒蛋白的合成，IE180是整個基因表達的反式作用因子[5-7]。IE180啟動子改變后的重組PRV不感染細胞，證明IE180的正常誘導(dǎo)表達與病毒能否感染培養(yǎng)細胞有關(guān)[8]。將PRV IE180基因兩個拷貝同時缺失，重組病毒不復(fù)制，不能產(chǎn)生子代病毒[9]。雖然IE180影響著細胞基因的表達，但IE180基因缺失的重組PRV仍能與穩(wěn)定表達IE180蛋白的Vero和PK-15細胞系存在著互補效應(yīng)，同時細胞系中IE180基因的表達對內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的增殖起到了強化作用[10]，同時IE180蛋白對細胞基因的影響仍需更進一步研究。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞、質(zhì)粒和主要酶與試劑 偽狂犬病病毒變異株JS-2012感染性細菌人工染色體pJS-2012BAC插入SW102菌株的陽性克隆SW102-PRVBAC、野毒株JS-2012、Vero細胞、BHK-21細胞、IE180多克隆抗體、pCAGGS-MCS載體、pCR-Blunt Ⅱ TOPO載體和pgalk載體均由本實驗室提供。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、大腸桿菌DH5α、Oligo dT反轉(zhuǎn)錄慢酶、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、Prime STAR Max DNA等PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司；胎牛血清、DMEM購自Gibco公司；Trizol（總RNA抽提試劑）、氨芐青霉素和氯霉素購買自Invitrogen公司；20%半乳糖、5×M63和1×M9購自生工生物工程（上海）有限公司；D-生物素購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；亮氨酸（Leucine）購自上海吉爾生化科技有限公司；SOC培養(yǎng)基購自上海前塵生物科技有限公司；凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及常用溶液的配制 氯霉素儲存液：500 mg氯霉素溶于20 mL無水乙醇中，混勻后于超凈臺中0.22 μm濾膜過濾除菌，-30℃保存?zhèn)溆??？敲顾貎Υ嬉海?00 mg卡那霉素溶于20 mL滅菌ddH2O中，混勻后于超凈臺中0.22 μm濾膜過濾除菌，-30℃保存?zhèn)溆?。M63溶液：（5×）2.5 mg七水硫酸鐵、10 g硫酸銨、68 g磷酸二氫鉀和8.58 g M63顆粒溶于110 mL ddH2O并調(diào)pH為7.0，高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆?。M9溶液：（1×）0.5 g氯化鈉、3 g磷酸二氫鉀、6 g磷酸氫鈉、1 g氯化氨和0.565 g M9顆粒溶于50 mL ddH2O中，高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆谩?0%Galactose：1 g Galactose溶解于9 mL去離子水中，定容至10 mL，高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆?。D-生物素（避光）：25 mL去離子水中融有5 mg D-生物素，0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0%細胞生長液：450 mL DMEM中加入50 mL FBS與2 mL青鏈霉素雙抗，混勻，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?%細胞維持液：500 mL細胞培養(yǎng)基中加入10 mL胎牛血清和2 mL青鏈霉素雙抗，混勻，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。LB液體培養(yǎng)基：10 g Tryptone、5 g Yeast Extract和10 g NaCl溶于800 mL ddH2O中，調(diào)pH為7.0，定容到1 L，高壓滅菌后加入相應(yīng)抗生素，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

麥康凱培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂粉10 g溶于200 mL去離子水中，高壓滅菌后冷卻至50℃左右加2 mL 20%Galactose和100 μL氯霉素，倒板備用。LB固定培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂粉，其余相同（倒板前冷卻至50℃左右時加抗生素）。galk正篩選培養(yǎng)基：高壓滅菌后的液體瓊脂（7.5 g瓊脂溶于0.8 L ddH2O），加入100 mL高壓滅菌后的5×M63溶液，定容到0.5 L。待冷卻至50℃左右加入2.25 mL L-亮氨酸、5 mL 20%Galactose、2.5 mL生物素、250 μL氯霉素倒平板備用。galk二次正篩選固體培養(yǎng)基：同galk正篩選培養(yǎng)基外，補加卡那霉素250 μL。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)要刪除的PRVJS-2012 IE180啟動子基因序列，設(shè)計擴增galk和Kna表達盒及兩端帶有50 bp同源臂的引物。所有引物均由上海英濰捷基有限公司合成，序列見表1。

表1 引物及序列Table 1 Primers and sequences used in this study

1.4 正篩選技術(shù)路線 正篩選：借助同源重組的方法，將galk基因插入并替換pJS-2012BAC的IE180基因啟動子及其兩端200 bp基因序列，生長于正篩選培養(yǎng)基上的菌落，基本上全是galk表達盒成功替換掉缺失部位的重組子菌落。正二篩：在首次篩選的基礎(chǔ)上，操作方法相同。將Kna抗性基因代替galk表達盒，替換pJS-2012BAC的另一個IE180基因啟動子序列。經(jīng)BamHⅠ酶切的長度多態(tài)性分析和PCR鑒定，雙拷貝啟動子缺失后全基因組序列沒有大片段的插入與缺失可獲得pJS-2012BAC的DIE180啟動子基因的克隆，正篩選構(gòu)建PRV IE180啟動子缺失病毒過程示意圖見圖1，IE180啟動子缺失位置分別在兩個基因拷貝的不同序列位置，其中一個缺失位置在反向拷貝啟動子兩端的左側(cè)297 bp和右側(cè)172 bp，而另外一個缺失位置在正向拷貝的啟動子兩端，即左側(cè)134 bp和右側(cè)309 bp。詳細示意圖見圖2。

圖1 構(gòu)建PRV IE180缺失病毒的正篩選示意圖Fig.1 Generation of IE180 promoter deleted PRV using the galk selection system and pJS-2012BAC

圖2 IE180啟動子缺失位置示意圖Fig.2 The schematic of IE180 promoter missing position

1.5 IE180兩個拷貝缺失克隆構(gòu)建中PCR擴增片段基因galk及Kna表達盒 分別用引物galkup/galkdown和Knaup/Knadown各1 μL以pgalk和pCR-Blunt Ⅱ TOPO質(zhì)粒為模板擴增片段基因galk及Kna表達盒。PCR擴增體系（50 μL）：2× buffer 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL；2.5 mmol/L dNTP 4 μL；Primer star高保真DNA聚合酶0.5 μL；質(zhì)粒模板2 μL；ddH2O 16.5 μL。Kna和galk基因PCR擴增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物加入2 μL DpnⅠ37℃酶切1 h，對PCR產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳分析，觀察擴增情況。膠回收目的片段，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 IE180兩個拷貝缺失克隆構(gòu)建的正篩選 分別用引物galkup/galkdown和Knaup/ Knadown擴增Galk和Kna的帶有缺失部分兩邊同源臂的篩選標(biāo)記基因。用圖1中的技術(shù)路線將IE180缺失部分進行替換。（1）和（2）操作步驟同文中正篩選[11]。（1）SW102-PRVBAC正篩選電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備。（2）正篩選的電轉(zhuǎn)化。（3）用麥康凱培養(yǎng)基對篩選到的正篩陽性克隆進行純化：挑取正篩選平板上的單菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基，使用跨galk引物L(fēng)galkup/Lgalkdown鑒定galk正確插入，PCR擴增體系與擴增程序同1.5。將正確插入galk的正篩陽性菌株提取質(zhì)粒后命名為pJS-2012BAC-galk保存于-20℃。本過程中所有的菌體培養(yǎng)模式均為避光培養(yǎng)且溫度不高于32℃。（4）IE180第二次正篩選（缺失IE180另一個拷貝啟動子）：在IE180一個拷貝啟動子缺失克隆SW102-IE180-galk的條件下進行另一個拷貝啟動子的缺失，操作步驟如上3.2.4中的（1）、（2）和（3），只是將過程中所需的抗性及篩選標(biāo)記基因進行替換。將Kna成功插入靶向位置并測序正確的陽性克隆質(zhì)粒命名為pJS-2012BAC-DIE180。

1.7 成功構(gòu)建IE180雙啟動子缺失克隆的鑒定

1.7.1 RFLP長度多態(tài)性分析 將質(zhì)粒pJS-2012BAC、pJS-2012BAC-galk和pJS-2012BAC-DIE180進行BamH Ⅰ單酶切，并進行核酸電泳檢測。具體的操作步驟如下：將質(zhì)粒pJS-2012BAC、pJS-2012BAC-galk和pJS-2012BAC-DIE180用BamHⅠ限制內(nèi)切酶于37℃水浴條件下酶切6 h，體系為：BamHⅠ限制性內(nèi)切酶3 μL，10×CutSmart Buffer 2.5 μL，質(zhì)粒pJS-2012BAC、pJS-2012BAC-galk和pJS-2012BAC-DIE180各4 μg，ddH2O補至25 μL。

1.7.2 Western blot分析及熒光表達 將質(zhì)粒pJS-2012BAC、pJS-2012BAC-galk和 pJS-2012BACDIE180各2 μg轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，轉(zhuǎn)染6 h后將轉(zhuǎn)染后的上清液換為含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，觀察綠色熒光表達情況。隨后對轉(zhuǎn)染后的細胞進行裂解收樣和SDS-PAGE電泳分析，IE180多克隆抗體作為一抗（1∶500稀釋），HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶5000稀釋），顯影后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 IE180兩個拷貝缺失克隆構(gòu)建中g(shù)alk及Kna表達盒PCR片段基因擴增結(jié)果 分別用引物galkup/galkdown和Knaup/Knadown擴增基因片段galk和Kna，擴增大小分別為1300 bp和1000 bp，與實際大小相符合（圖3），并且測序結(jié)果與目的序列一致。

圖3 質(zhì)粒擴增galk（A）和Kna（B）表達盒的核酸電泳圖Fig.3 Electrophoresis of amplified galk (A) and Kna (B)fragment

2.2 IE180缺失克隆的兩次正篩選鑒定 第一次正篩選（將galk基因表達盒替換IE180基因啟動子缺失部分）后用Lgalkup/Lgalkdown進行PCR鑒定，鑒定galk表達盒是否成功替換IE180啟動子缺失部分，鑒定長度為842 bp，與實際大小相符（圖4）。PCR鑒定后擴增序列經(jīng)過測序，與實際序列相吻合（圖5）。將第一次正篩選得到的陽性克隆用跨IE180啟動子缺失的引物IE180up/down進行PCR鑒定，鑒定長度為1260 bp，與實際大小相符合（圖4）。由圖4的A和B得知IE180另外一個拷貝啟動子依然存在，在此基礎(chǔ)上進行Kna的二次正篩選刪除另一拷貝IE80啟動子。用Kna表達盒代替上述galk表達盒進行二次正篩選，篩選PCR鑒定長度為772 bp，與預(yù)期大小相同（圖4），對二次正篩選的陽性克隆用引物IE180up/down進行PCR鑒定，鑒定IE180兩個拷貝啟動子是否均刪除，與陽性對照（pJS-2012BAC）相比，正篩陽性克?。╬JS-2012BAC-DIE180）無擴增條帶（圖4）。經(jīng)二次正篩而篩選到陽性克隆經(jīng)測序，鑒定Kna篩選標(biāo)記基因插入位置與預(yù)期位置相同（圖6）。

圖4 IE180缺失克隆正篩選PCR鑒定Fig.4 IE180 deletion clone positive screening PCR identification

圖5 比對PRVJS-2012和pJS-2012BAC-galk測序結(jié)果Fig.5 Comparison of sequencing results between PRVJS-2012 and pJS-2012BAC-galk site

2.3 鑒定IE180雙啟動子缺失克隆的成功構(gòu)建 利用RFLP長度多態(tài)性分析質(zhì)粒pJS-2012BAC、pJS-2012BAC-galk和pJS-2012BAC-DIE180經(jīng)BamHⅠ酶切后的片段差異：將質(zhì)粒pJS-2012BAC、pJS-2012BAC-galk和pJS-2012BAC-DIE180用BamHⅠ限制性內(nèi)切酶進行酶切，經(jīng)0.8%瓊脂糖核酸電泳分析，發(fā)現(xiàn)3個泳道的條帶數(shù)量和大小無差異，與預(yù)期結(jié)果相符合（圖7）。經(jīng)過DNAStar軟件分析后，啟動子刪除序列、galk基因序列和Kna基因序列內(nèi)均無BamHⅠ的酶切位點，所以核酸電泳后3個質(zhì)粒基因序列的酶切長度無差異。利用p J S-2 0 1 2 B A C、p J S-2 0 1 2 B A C-g a l k和pJS-2012BAC-DIE180質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光表達情況。3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞30 h后，觀察到pJS-2012BAC和pJS-2012BAC-galk均有綠色熒光表達，但pJS-2012BAC-galk相對于pJS-2012BAC綠色熒光少；pJS-2012BAC- DIE180無綠色熒光表達（圖8）。

圖7 SW102-DIE180 RFLP分析結(jié)果Fig.7 RFLP analysis results of SW102-DIE180

圖8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21 細胞Fig.8 Transfection results of the plasmids in BHK-21 cells

利用IE180多克隆抗體檢測pJS-2012BAC、pJS-2012BAC-galk和pJS-2012BAC-DIE180 3個質(zhì)粒IE180蛋白的表達情況：將質(zhì)粒pJS-2012BAC、pJS-2012BAC-galk和pJS-2012BAC-DIE180各2 μg轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，24 h后進行收樣，進行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)pJS-2012BAC和pJS-2012BAC-galk均有IE180蛋白的表達，而pJS-2012BAC-DIE180無IE180蛋白的表達情況（圖9）。

圖9 Western blot分析IE180蛋白的表達Fig.9 The expression of IE180 by Western blot analysis

3 討論

偽狂犬病病毒（PRV）自出現(xiàn)以來給我國養(yǎng)豬業(yè)造成極大經(jīng)濟損失，因該病存在著潛伏期難以達到凈化與根除而成為養(yǎng)豬業(yè)非常重要的一種疾病，目前對于PRV的研究日漸增多，但對于其防控卻仍面臨著許多挑戰(zhàn)[12-13]。

本研究成功構(gòu)建了將IE180雙拷貝啟動子刪除的含BAC DNA的重組質(zhì)粒pJS-2012BAC-DIE180。本操作方法簡單、快速、高效[14]。在首次正篩選插入galk之后利用同樣的方法插入Kna篩選標(biāo)記基因，Kna是菌株的篩選標(biāo)記，因而不會對細胞產(chǎn)生影響[15]。利用BAC反向遺傳操作和galk正篩選系統(tǒng)缺失PRV IE180基因啟動子，經(jīng)過PCR鑒定發(fā)現(xiàn)啟動子刪除部分仍然存在，由此得知此方法只能將IE180其中一個拷貝的啟動子刪除，所以在上述方法的基礎(chǔ)上在第二個拷貝啟動子刪除部分插入Kna篩選標(biāo)記基因替換掉要刪除的啟動子部分。不同的篩選標(biāo)記基因Kna和galk同源重組替換掉IE180兩個拷貝啟動子刪除部分，經(jīng)特異性引物的PCR鑒定和測序結(jié)果證明兩個拷貝的啟動子成功刪除。前期研究已經(jīng)表明，IE180是驅(qū)動PRV其他基因轉(zhuǎn)錄復(fù)制的必需基因，如果IE180不能表達，則整個病毒喪失感染能力，病毒基因組不能進行復(fù)制，不能產(chǎn)生子代病毒。本研究將IE180啟動子缺失克隆pJS-2012-DIE180和質(zhì)粒pJS-2012-galk、pJS-2012BAC分別轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，經(jīng)過免疫熒光實驗和Western blot分析均表明pJS-2012DIE180轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后未表達IE180蛋白；而pJS-2012-galk和pJS-2012BAC綠色熒光均正常表達，但pJS-2012-galk相對于pJS-2012BAC表達量低；pJS-2012-galk和pJS-2012BAC的IE180蛋白正常表達。結(jié)果證實IE180啟動子缺失克隆構(gòu)建成功，為進一步構(gòu)建IE180互補缺失系統(tǒng)及生物學(xué)功能的探究奠定理論基礎(chǔ)。

IE180作為PRV唯一的一個立即早期基因，在其啟動子缺失的情況下，IE180不表達且不能引起PRV整個基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。IE180雙啟動子缺失克隆的成功構(gòu)建，為后期研究IE180互補缺失系統(tǒng)及探尋PRV基因組中與IE180調(diào)控機制相關(guān)的表達分子提供工具，并且為進一步探究IE180的功能做理論基礎(chǔ)。