張 飄，楊 霞，胡安東，潘吉脈，劉妍罕，曾茂芹，程振濤,3，姜海波,3，文 明,3

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴陽 550025；3.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽 550025）

鱘魚起源于2億年前的古老硬骨魚類，屬于硬骨魚綱（Osteicthyes）、輻鰭亞綱（Actinopterygii）、硬鱗總目（Chondrostei）、鱘形目（Acipenseriormes）全世界共有2科6屬27種，我國分布有8種[1-2]。鱘魚是世界上現(xiàn)存起源最早的脊椎動物之一，是體型最大的軟骨硬鱗類淡水魚[3]。鱘魚肉中的含水量與脂肪含量高于大部分淡水魚，因其做成的魚子醬非常美味，目前鱘魚產(chǎn)業(yè)以魚子醬加工為主，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[4]。雜交鱘在鱘魚產(chǎn)業(yè)中占有極其重要的比例[5]，又表現(xiàn)出優(yōu)良的生長和抗病性能[6]，因此近幾年雜交鱘在冷水養(yǎng)殖中占據(jù)的比例越來越高，極具研究價值。病理變化分析可以客觀反應(yīng)機(jī)體生理過程，為魚類疾病發(fā)生過程及引起的主要損傷提供依據(jù)，但目前關(guān)于雜交鱘魚病理變化的分析報道卻相對較少。

殺鮭氣單胞菌是一種嗜冷無動力的氣單胞菌，廣泛分布于淡水與海水環(huán)境中，殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）屬氣單胞菌科（Aeromonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），是一種不能運動、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌, 其最適生長溫度為22℃～25℃，35℃以上不生長，為一種條件致病菌，是主要引起癤瘡病的病原菌，曾經(jīng)給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的困擾[7]。本實驗室曾經(jīng)接收到疑似感染殺鮭氣單胞菌而發(fā)病的雜交鱘，但均未分離到可以引起該癥狀的相關(guān)細(xì)菌，也未分離到殺鮭氣單胞菌。目前國內(nèi)外并沒有關(guān)于殺鮭氣單胞菌感染鱘魚的相關(guān)報道，基于這種情況，本研究采用同為冷水魚的虹鱒魚體內(nèi)分離得到的殺鮭氣單胞菌對雜交鱘進(jìn)行人工感染，感染后觀察殺鮭氣單胞菌對雜交鱘是否有感染性并對其臨床癥狀、解剖學(xué)變化、病理變化情況進(jìn)行初步探究，旨在為鱘魚癤瘡病診斷提供一些有效的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人工感染使用的殺鮭氣單胞菌于2019年7月分離于貴州省某養(yǎng)殖場發(fā)病虹鱒魚體內(nèi)，由貴州大學(xué)動物科學(xué)疫病研究所保存；雜交鱘【史士鱘（Acipenser schrenckii）♀×西伯利亞鱘（Acipenser baeri）♂】共60尾，購自貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)研究所，體長55±5cm，體重0.8±0.1 kg；腦興浸出液（brain heart infusion broth，BHI）肉湯培養(yǎng)基、病理切片材料均購自賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實驗菌種 將菌種從-80℃中取出，待其中冰塊融化后，于操凈工作臺中加入已經(jīng)配制好并滅菌的BHI液體培養(yǎng)基中，放置于28℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜。采用麥?zhǔn)媳葷岱?，將殺鮭氣單胞菌的菌懸液濃度調(diào)整到約1×109CFU/mL，并將其濃度依次倍比稀釋為1×108、1×107、1×106、1×105CFU/mL備用。

1.3 半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）的測定 實驗所用雜交鱘均為同一體系，大小與健康情況基本相同。實驗前魚缸中馴養(yǎng)7 d，讓其適應(yīng)環(huán)境，減小由于應(yīng)激帶來的影響，實驗前停食1 d，每天更換1/3水量，實驗過程中不喂食。50尾雜交鱘隨機(jī)分成5組，每組10尾。分別臀鰭注射0.1 mL不同濃度殺鮭氣單胞菌，間隔12 h觀察1次雜交鱘活動狀態(tài)及死亡情況，直到不再出現(xiàn)雜交鱘死亡，對死亡雜交鱘無菌采取肝臟組織后進(jìn)行殺鮭氣單胞菌的16S rDNA 和毒力基因的PCR擴(kuò)增檢測。其中，氣溶素（aerolysin，Aer）、絲氨酸蛋白酶（serine protease，Ser）、熱不穩(wěn)定性腸毒素（heat-labile enterotoxins，Alt）、酯酶（lipase，Lip）、細(xì)胞毒性腸毒素（cytotoxic enterotoxin，Act）、溶血素（haemolysin A，hly A）PCR引物信息與退火溫度參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，16S rDNA PCR鑒定后送往生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果上傳NCBI進(jìn)行比對，確定其死亡原因。根據(jù)改良寇氏法（LD50（lg（LD50）= Xm-d（∑Pi-0.5））；其中：Xm為最大劑量對數(shù)；d為相鄰兩組劑量對數(shù)之差數(shù)；Pi為死亡率，i為組號）計算臀鰭注射半數(shù)致死量。

1.4 樣品的采集 與半數(shù)致死量測定分組相同條件，選取10尾雜交鱘分為2組，正常對照組5尾，人工感染組5尾，人工感染組均注射相同濃度半數(shù)致死量以下的菌液0.2 mL，對照組均注射同等體積的滅菌生理鹽水，在96 h宰殺實驗組5尾作為生物學(xué)重復(fù)。觀察雜交鱘體表及體內(nèi)各組織器官病理變化后，取腸、肝臟、肌肉、心臟、鰓和脾臟放置于組織固定液中，24 h后用70%酒精沖洗并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 人工感染前后的組織變化 將70%酒精中保存的病理組織和健康組織，經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，組織切片，蘇木精和伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，中性樹膠封片后，送賽維爾生物科技有限公司做全景掃描。

2 結(jié)果

2.1 半數(shù)致死量及PCR結(jié)果 將不同濃度的殺鮭氣單胞菌菌液臀鰭注射到健康雜交鱘體內(nèi)，在感染24 h 后，注射菌液濃度為1.0×109CFU/mL和1.0×108CFU/mL兩組魚開始出死亡，感染168 h后菌液濃度為1.0×109CFU/mL組死亡率達(dá)100%（表1）。經(jīng)改良寇氏法計算臀鰭注射半數(shù)致死量為7.9×106CFU/mL，這表明殺鮭氣單胞菌對雜交鱘有致病及致死性，會引起雜交鱘發(fā)病及死亡。從感染發(fā)病死亡雜交鱘體內(nèi)無菌采集肝臟組織進(jìn)行16S rDNA與毒力基因檢測PCR（圖1），并進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果上傳NCBI比對顯示為殺鮭氣單胞菌，因此認(rèn)定殺鮭氣單胞菌可以引起雜交鱘的死亡，毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌存在Aer、Ser、Alt、Act、HlyA等毒力基因。

圖1 殺鮭氣單胞菌 16S rDNA (A)、毒力基因序列(B)的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA (A) and virulence gene sequences (B) of Aeromonas salmonicida

表1 人工感染感染雜交鱘LD50Table 1 Artificial infection of hybrid sturgeon LD50

2.2 人工感染后臨床癥狀 對雜交鱘腹腔注射0.1 mL殺鮭氣單胞菌，濃度為1.0×109CFU/mL和1.0×108CFU/mL。兩組在12 h前，魚沉于魚缸底部或吸附缸壁，無其他癥狀，12 h后部分魚表現(xiàn)出發(fā)狂，撞擊缸壁，24 h后出現(xiàn)死亡，而低濃度組未出現(xiàn)發(fā)狂癥狀，主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍，用手觸摸不反應(yīng)。對發(fā)病雜交鱘飼養(yǎng)水體進(jìn)行觀察，主要表現(xiàn)：體表黏液分泌量增多，表現(xiàn)為水體比正常對照組粘稠渾濁，且注射菌液組濃度越高變化越明顯。

對發(fā)病雜交鱘體表進(jìn)行觀察，主要表現(xiàn)：腹壁出現(xiàn)大量出血點，腹壁兩側(cè)或尾部形成膿腫，嚴(yán)重的出現(xiàn)潰瘍灶，發(fā)生壞死（圖2A、2B），其他部位未見有明顯病變，出血點主要集中在背鰭、胸鰭與腹鰭基部，肛門處有出血與紅腫，少數(shù)帶有血便（圖2C）；潰瘍灶主要集中在腹鰭周圍（圖2D），鰓絲出現(xiàn)大量出血點，鰓蓋未見異常（圖2E）。對發(fā)病雜交鱘刨解觀察，腹腔未見積液，但兩側(cè)腹壁與脂肪組織有出血點，脂肪組織嚴(yán)重的出現(xiàn)潰瘍壞死（圖2F）；肝臟組織顏色發(fā)白，而且伴有大量出血點（圖2G）；脾臟腫大變脆并伴有出血點（圖2H）；腸壁有出血點，腸道未見內(nèi)容物及脹氣現(xiàn)象（圖2I）。

圖2 雜交鱘人工感染后的主要臨床癥狀Fig.2 Main clinical symptoms of artificial infection of hybrid sturgeon

2.3 病理組織學(xué)分析 比較正常對照組和人工感染組雜交鱘各器官切片變化發(fā)現(xiàn)，感染后雜交鱘鰓、肌肉、脂肪、腸道和心臟等組織均有明顯的病理變化。與正常對照雜交鱘鰓（圖3A）相比，人工感染殺鮭氣單胞菌后雜交鱘鰓的主要病理變化為鰓絲短小扭曲，鰓絲軟骨排列凌亂，鰓小片排列不齊、彎曲或皺縮，嚴(yán)重者出現(xiàn)壞死斷裂脫落，鰓絲和部分鰓小片充血，甚至在鰓小片末端形成血腫（圖3B）；與正常對照組（圖3C、3E）比較可以看出，人工感染殺鮭氣單胞菌后雜交鱘病理組的肌纖維間隙較大，肌纖維密度明顯減少（圖3D），肌纖維扭曲、排列紊亂, 纖維斷裂崩解, 橫紋由不清晰到完全消失（圖3F）；與正常對照組（圖3G）比較，人工感染殺鮭氣單胞菌后雜交鱘脂肪組織有大量的血細(xì)胞浸潤，形成大面積血細(xì)胞斑塊（圖3H）；與正常對照組（圖3I）比較，人工感染殺鮭氣單胞菌后雜交鱘腸腔中充滿變性、脫落、壞死的上皮細(xì)胞，腸道絨毛發(fā)生崩解脫落，并有血細(xì)胞和少量炎性細(xì)胞浸潤（圖3J）；正常情況鱘魚心外膜具一個個卵圓形的“結(jié)節(jié)”，這些“結(jié)節(jié)”外層由致密結(jié)締組織形成，每個結(jié)節(jié)間由疏松結(jié)締組織或脂肪組織連接，“結(jié)節(jié)”的內(nèi)部是腔室（圖3K），人工感染雜交鱘心臟的病理變化主要發(fā)生在心肌細(xì)胞，可見心肌纖維扭曲、排列紊亂，纖維斷裂崩解，橫紋由不清晰（圖3L）；與正常對照組比較（圖3M），人工感染殺鮭氣單胞菌后雜交鱘肝組織中央靜脈擴(kuò)張并有少量血細(xì)胞，中央靜脈周圍有炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞排列紊亂，腫脹，并發(fā)生明顯的空泡化脂肪變性或水樣變性，細(xì)胞界限模糊不清，均有不同程度的脂肪肝（圖3N）；與正常對照組（圖3O）比較，人工感染殺鮭氣單胞菌后雜交鱘脾組織毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，嚴(yán)重區(qū)域破裂出血及溶血，形成血斑（圖3P）。

圖3 雜交鱘人工感染殺鮭氣單胞菌正常對照與病理組織切片F(xiàn)ig.3 Normal control and pathological section of artificial infection of hybrid sturgeon by Aeromonas salmonicida

3 討論

癤瘡病是一種普遍存在的疾病，它影響著世界范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖，其特點是發(fā)病率高，死亡率高[9]，殺鮭氣單胞菌為該病主要病原體。自從Emmerich[10]于1984年首次從患病溪鱒（Salvelinus fontinalis）中分離到該病原菌以來，其宿主范圍逐年擴(kuò)大到除鮭科魚類外的鯉科（Cyprinidae）、鰭科（Serranidae）、鰻鱺科（Anguillidae）、鲆科（Bothidae）等魚類，在豬[11]、羊[12]中也有分離到該菌，而且其宿主范圍還在不斷擴(kuò)大，有引起金魚、鯉魚等鯉科魚類的潰瘍病和紅皮炎的報道[13-15]，目前尚未有在鱘魚中分離到該菌的相關(guān)報道。貴州省地處中國西南內(nèi)陸腹地，因其得天獨厚的水資源，近年來大力發(fā)展虹鱒、鱘等冷水魚的養(yǎng)殖，但隨著養(yǎng)殖密度的不斷加大及養(yǎng)殖技術(shù)的不成熟，各種細(xì)菌及病毒病相繼暴發(fā)。自2019年來，有多個養(yǎng)殖場鱘魚暴發(fā)類似癤瘡病癥狀的疾病，但送來本實驗室后，病毒檢測及細(xì)菌的分離培養(yǎng)均未取得較好的效果，這其中可能是因為沒有對發(fā)病雜交鱘進(jìn)行16S rDNA檢測，外加上在進(jìn)行細(xì)菌分離的時候沒有選擇合適的培養(yǎng)基，僅僅只是使用了普通培養(yǎng)基?；诖饲闆r本研究對雜交鱘進(jìn)行雜交鱘殺鮭氣單胞菌人工感染，感染后觀察殺鮭氣單胞菌對雜交鱘是否有感染性，并對其臨床癥狀、解剖學(xué)變化、病理變化情況進(jìn)行初步探究。

人工感染試驗表明，從患癤瘡病的虹鱒魚中分離到的殺鮭氣單胞菌菌株可感染健康雜交鱘，造成雜交鱘發(fā)病死亡，經(jīng)計算臀鰭注射半數(shù)致死量為7.9×106CFU/mL，表明殺鮭魚氣單胞菌對雜交鱘具有較強(qiáng)的致病性和致死性。在雜交鱘感染后，與Scott等[16]報道鮭魚感染殺鮭氣單胞菌后，脾臟腫大，肝臟被膜下出血，腸道無食出血等癥狀相似；與李紹戊等[17]報道在大西洋鮭感染殺鮭氣單胞菌后，尾側(cè)或者在體側(cè)形成特征性膿腫，嚴(yán)重時形成潰瘍結(jié)果相似，而這些潰瘍最后主要形成爛皮；與Wiklund等[18]研究結(jié)果相似，但刁菁等[19]結(jié)果中會引起虹鱒魚體色發(fā)黑有差異，剖檢可見肝臟、脂肪組織出現(xiàn)點狀出血等典型癥狀相同；與楊移斌等[15]報道在斑點叉尾鲙感染殺鮭氣單胞菌后，眼球呈凸起狀，有大量腹水積存等癥狀不同，而導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能為毒力因子的不相同，毒力因子的不同導(dǎo)致不同菌株間致病力和致病后癥狀的不同[20]，也有相關(guān)報道稱該病的發(fā)生與溫度密切相關(guān)[21]，溫度的不同也許會導(dǎo)致疾病的發(fā)展不同。

對雜交鱘人工感染殺鮭氣單胞菌后，其主要的病理變化為出現(xiàn)充血、出血、溶血的病理過程，進(jìn)而引起實質(zhì)細(xì)胞顆粒變性和空泡變性，病情嚴(yán)重時發(fā)展到壞死，形成彌散性壞死灶，肝臟空泡化，中央靜脈擴(kuò)張少量出血，心臟出現(xiàn)心肌纖維扭曲、排列紊亂，纖維斷裂崩解的病理現(xiàn)象，與嗜水氣單胞菌感染雜交鱘[22]后的病理現(xiàn)象相似。但其在臨床上有較大差別的是，臨床上肝臟中空泡化可能是由于飼養(yǎng)過程中能量過高引起的脂肪蓄積呈現(xiàn)的現(xiàn)象。值的注意的是，這些變化均為毒力因子引起的[23]，引起這些病理變化的毒力因子是否相同，尚需要進(jìn)一步的研究，但可以肯定的是殺鮭氣單胞菌與嗜水氣單胞菌感染雜交鱘后的病理變化存在相同之處。本實驗使用虹鱒魚源殺鮭氣單胞菌對雜交鱘進(jìn)行人工感染，發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌可以引起雜交鱘發(fā)病，主要癥狀與癤瘡病相似，可以引起雜交鱘死亡，臀鰭注射半數(shù)致死量為7.9×106CFU/mL。病理切片觀察可見多組織器官發(fā)生充血、出血、溶血等病理現(xiàn)象。本實驗為雜交鱘相關(guān)細(xì)菌疾病的診斷提供了新的理論依據(jù)。