葛菲菲，吳 杰，李 鑫，劉 健，楊德全，鞠厚斌，周錦萍

（1.上海市動物疫病預防控制中心，上海201103；2.揚州大學生物科學與技術(shù)學院，揚州225009）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）為單股負鏈RNA病毒，基因組由8個基因節(jié)段組成。H9N2亞型AIV是中國大陸家禽中最普遍的AIV之一[1]，在家禽中穩(wěn)定并持續(xù)存在，對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重損失和對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。其中G57基因型H9N2亞型AIV在2007年出現(xiàn)，并在2010年至2014年占據(jù)主導位置[2]。H9N2亞型禽流感病毒的6個內(nèi)部基因節(jié)段是新型H7N9和H10N8亞型禽流感病毒的重配來源[3-4]。人H5N1、H7N9和H10N8亞型禽流感病毒的感染來源主要為活禽市場[5-7]。本研究對上海市活禽市場2018年6月分離到的6株H9N2亞型AIV進行全基因進化分析，為了解上海地區(qū)H9N2 AIV流行情況及其防控和候選疫苗選擇提供有效的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病毒株 6株H9N2亞型AIV毒株由本實驗室參照文獻[8]分離保存，其詳細背景見表1。

表1 本研究中6株 H9N2禽流感病毒毒株的信息Table 1 Information of the six H9N2 subtype Avian influenza virus isolates

1.2 實驗動物及主要試劑 SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；H9熒光RT-PCR試劑盒由深圳匹基生物工程股份有限公司提供；新城疫陽性血清、禽流感血凝素分型血清（H5、H9）由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；AMV反轉(zhuǎn)錄酶等試劑均購自寶生物（大連）工程公司；特異引物由寶生物（大連）工程公司合成。

1.3 8個基因的擴增及序列分析 按照文獻報道[9]的方法進行病毒RNA的提取和8個基因的全長擴增，測序由上海桑尼生物科技有限公司完成。參照GenBank中相關(guān)參考病毒株，利用Mega6.0軟件進行序列的系統(tǒng)進化分析。

2 結(jié)果

2.1 全基因組同源性分析結(jié)果 6株病毒全基因片段的NCBI登錄號為MK053830-053877。分離株HA基因ORF全長為1683 bp，編碼560個氨基酸，核苷酸同源性為94.2%～99.3%，氨基酸序列同源性為93.9%～99.1%。分離株的HA基因與A/Duck/Y280/1997的HA基因核苷酸同源性為88.1%～99.3%，氨基酸同源性為89.7%～99.1%。分離株NA基因ORF全長為1401 bp，編碼466個氨基酸，核苷酸同源性為96.0%～99.5%，氨基酸序列同源性為96.6%～99.6%。6株病毒內(nèi)部基因M、NP、NS、PA、PB1和PB2核苷酸同源性分別為96.7%～99.7%、94.9%～99.7%、95.7%～99.4%、96.2%～98.9%、96.5%～99.9%、96.1%～99.9%。

2.2 HA基因關(guān)鍵位點分析 所有分離株的HA裂解位點均為RSSR↓GLF，為弱毒序列；受體結(jié)合位點的左緣（146 aa-150 aa）除了A/Chicken/Shanghai/07/2018為GTSKA，其余5株均為GTSTA；6株分離株HA唾液酸受體結(jié)合位點處氨基酸在191位為N（天冬酰胺），與經(jīng)典的AIV國內(nèi)分離株一致[10]。A/Chicken/Shanghai/07/2018在198位變異為A（丙氨酸），其余毒株均為T（蘇氨酸）。A/Chicken/Shanghai/06/2018和A/Chicken/Shanghai/10/2018在202位和203位分別為R（精氨酸）以及F（苯丙氨酸），其余毒株在202位和203位分別均為L（亮氨酸）和Y（酪氨酸）。本研究中的毒株在受體結(jié)合位點的右緣（232 aa～237 aa）均為NGLMGR；此外本研究表明這6株毒株在HA基因226位點均為Leu，表明有向人類感染的嗜性[11-12]（表2）。這6株病毒株的糖基化位點詳見表3。

表2 H9N2分離株HA基因關(guān)鍵位點的比較Table 2 Comparison of several key sites of H9N2 subtype Avian influenza virus isolates

表3 分離株HA基因糖基化位點分析Table 3 Potential glycosylation sites of HA amino acid sequences in six H9N2 isolates

2.3 NA基因關(guān)鍵位點分析 對這6株分離株的紅細胞結(jié)合位點，活性中心以及抗原決定簇進行了分析（表4），A/Chicken/Shanghai/10/2018（H9N2）和A/Chicken/Shanghai/11/2018（H9N2）在紅細胞結(jié)合位點403位發(fā)生突變，在活性中心143位（同時為抗原決定簇的143位）發(fā)生突變，其余位點這6株病毒均保守。

表4 分離株NA氨基酸分析Table 4 Molecular characteristics of NA amino acid sequences in H9N2 isolates

2.4 HA基因遺傳進化分析 利用Mega6.0軟件對分離病毒株和參考病毒株HA基因的遺傳進化關(guān)系繪制遺傳進化樹（圖1）。結(jié)果顯示，所有分離株均為Y280系。

圖1 6株H9N2亞型禽流感病毒HA的基因進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of HA genes of the six H9N2 subtype Avian influenza viruses

2.5 6株分離株的8個基因片段的重組模式 根據(jù)繪制的8個基因片段的遺傳進化樹分析（表5），6株分離株的重組模式完全相同，均為四重重組體，由Y280亞系、Unknown、G1以及F98重組而成，根據(jù)參考文獻[13]判斷，這6株病毒均屬于G57基因型。

表5 8個基因片段的基因型組成Table 5 The genotypes of H9N2 subtype Avian influenza virus

3 討論

對于AIV的監(jiān)測始于20世紀70年代，然而流行病學的檢測僅局限于養(yǎng)殖場、屠宰場及野生禽類中進行，直至1997年香港H5N1亞型AIV直接感染人并致人死亡事件的發(fā)生，活禽市場在AIV流行傳播中的重要性被重視起來，對AIV流行情況的檢測才逐漸開始[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)6株分離株的HA基因第226位受體結(jié)合位點的氨基酸均為亮氨酸（Leu），已知HA基因中Q226L的突變能夠與人類受體結(jié)合，呈現(xiàn)典型的人流感受體結(jié)合的特征[11,15]；另外，本研究的6株H9N2亞型AIV基因裂解位點的序列均為P-S-R-S-S-R或P-A-R-S-S-R，并未出現(xiàn)多個堿性氨基酸的突變，有研究表明在HA裂解位點P5位置（316位點，H9編碼）由丙氨酸到絲氨酸突變使得裂解位點氨基酸從模式-PARSSR-向-PSRSSR-的變異會增加病毒的毒力[16]。6株分離株HA蛋白第198、202和203位受體結(jié)合位點有所不同。A/Chicken/Shanghai/02/2018、A/Chicken/Shanghai/06/2018和A/Chicken/Shanghai/07/2018均有8個潛在糖基化位點，其余3個毒株存在9個潛在糖基化位點，有研究表明HA附加的糖基化位點和H9N2型AIV在家禽中的適應性之間存在聯(lián)系[17]。

根據(jù)Zhu等[18]的研究，我們發(fā)現(xiàn)與2011-2014年中國分離的H9N2流感病毒相比，HA關(guān)鍵位點突變基本相似，對HA潛在糖基化位點的分析表明分離毒株與之前流行毒株相比未發(fā)生明顯變化。本研究中的6株分離株NA上紅細胞結(jié)合位點保持一致，與2011-2014年的毒株相比有位點發(fā)生突變；在NA活性中心只有A/Chicken/Shanghai/10/2018和A/Chicken/Shanghai/11/2018與2014年的2株分離株JS/TM71/14和AH/WB/14完全相同；與上述文獻中的報道相比，NA上抗原決定簇主要的變異發(fā)生在367-370位和400-403位。

目前國內(nèi)流行的H9N2亞型AIV的HA、NA雖然以CK/Bei-like分支基因型為主，但其內(nèi)部基因經(jīng)常被其他分支的基因片段所取代，出現(xiàn)越來越多的重組基因型。Gao等[3]研究表明，G57基因型在2007年出現(xiàn)，其流行率在2009年劇增，并自2010年后在中國占主導地位。本研究分離的6株H9N2亞型AIV均屬于G57基因型，表明上海地區(qū)在2018年還是以G57基因型為主。綜上所述，目前上海市活禽市場H9N2亞型AIV雖然以G57基因型為主，但其受體位點和糖基化位點等呈現(xiàn)多樣化，一些關(guān)鍵位點的突變有可能引起感染性和傳播力的增強，以上發(fā)現(xiàn)都值得進一步研究。同時H9N2亞型AIV內(nèi)部基因為其他亞型AIV提供內(nèi)部片段，加大了對人類健康的威脅，所以應該對其監(jiān)測防控工作給予重視，有效防止新的疫情的發(fā)生。