王景隆，全東群，莫清榮，馮建遠，王 豪，曾 悅，任同偉，王玉旭，陳 櫻，歐陽康，黃偉堅，韋祖樟

（1.廣西大學動物科學技術(shù)學院 動物傳染病與分子免疫學實驗室，南寧 530005；2.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團金光有限公司，南寧 530005）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種能夠使懷孕母豬流產(chǎn)、死胎以及仔豬、育肥豬生長緩慢、呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)損傷為主要特征的高度接觸性傳染病[1-2]。該病于1987年在美國首次被發(fā)現(xiàn)，主要臨床表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和新生仔豬的呼吸道疾病，隨后全世界范圍內(nèi)相繼暴發(fā)該病[3]。PRRSV是一種單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒，其基因組包括至少10個開放閱讀框，即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7[4-6]。根據(jù)基因組核苷酸序列及抗原性差異，將PRRSV分為兩種不同的類型，即PRRSV1和PRRSV2[7]。2008年，美國學者分離到了1株在Nsp2的高變區(qū)有著131（111+1+19）個氨基酸的不連續(xù)缺失的毒株，將其命名為NADC30。2012年起，與NADC30具有相似性的PRRSV變異毒株（NADC30-like）在我國大部分地區(qū)流行[8]。有研究表明，目前正在廣泛使用的商業(yè)化疫苗對NADC30-like病毒株僅能提供有限的免疫保護作用，而自然重組使得該病在臨床上的防治更加困難[9-10]。本研究對廣西某豬場采集到疑似PRRSV的肺臟組織進行檢測，結(jié)果為陽性。隨后利用PAM細胞從病料組織中成功分離出1株P(guān)RRSV毒株，并對其進行鑒定分析，為廣西地區(qū)的PRRSV防控提供了借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 病料及處理 病料樣品為廣西某豬場采集到疑似PRRSV的肺臟組織，剪碎研磨處理后用于病毒RNA的提取。

1.2 主要試劑TaqMix、RNase酶抑制劑、dNTP Mixture、M-MLV購自TaKaRa公司；MEM、新生胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；PAM細胞由本實驗室保存。

1.3 引物信息 參照已發(fā)表的NADC30的全基因組序列，分別設(shè)計了3對特異性引物，用于對GP5和Nsp2的擴增。引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 本研究中使用的PRRSV擴增引物Table 1 Primers for PRRSV amplification in this study

1.4 毒株分離及鑒定

1.4.1 PRRSV鑒定 取制研磨好的病料上清液，按照試劑盒說明書提取病毒RNA，用隨機引物反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以N1/N2為引物進行PCR檢測，反應程序：94℃預變性2 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行檢測。

1.4.2 病毒的分離 取陽性病料的組織研磨液，3000×g離心10 min后用0.22 μL的濾器過濾獲取病毒液。PAM細胞經(jīng)復蘇后培養(yǎng)于6孔板中，待完全貼壁時，棄去培養(yǎng)基，用300 μL兩倍稀釋的混合病毒液接種生長良好的細胞，在37℃的CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，棄去上清液，每孔加入2 mL含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2～4 d，逐日觀察細胞病變（cytopathic effect，CPE)。當有80%的細胞出現(xiàn)CPE時收獲上清液，取300 μL病毒液再連續(xù)傳3代。將收獲的細胞病毒液進行RNA抽提和RT-PCR檢測，方法同1.4.1。同時利用針對PRRSV N蛋白的特異性單克隆抗體進行間接免疫熒光的特異性實驗。

1.5 ORF5和部分Nsp2基因的擴增 取已鑒定為陽性的PRRSV GXNN1839株P(guān)3代細胞毒提取RNA。用隨機引物42℃反轉(zhuǎn)錄1 h制備cDNA于-20℃存放備用。用ORF5-F/ORF5-R和Nsp2-F/Nsp2-R為引物分別進行PCR反應。反應程序為：94℃預變性3 min；98℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.6 ORF5和部分Nsp2基因序列分析 對目的條帶進行膠回收，克隆成功后送測序。利用生物學軟件Lasergene、Mega6.0等對獲得的序列進行分析。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV的檢測 經(jīng)RT-PCR檢測，該肺臟組織為PRRSV陽性，擴增出的目的條帶在443 bp左右（圖1），與預期大小一致。

圖1 PRRSV RT-PCR檢測Fig.1 Detection of PRRSV by RT-PCR

2.2 病毒分離培養(yǎng)及鑒定 將過濾好的病料接種PAM細胞，36 h后開始出現(xiàn)CPE，48 h后可看到細胞皺縮、聚堆、脫落等（圖2）。收毒后進行IFA實驗，結(jié)果顯示，接毒的PAM細胞有特異的紅色熒光出現(xiàn)（圖3A），而未接毒的陰性細胞中沒有熒光（圖3B）。由此，鑒定所分離到的病毒為PRRSV。

圖2 PRRSV分離株在PAM細胞上的CPEFig.2 CPE of PAM cells infected with PRRSV isolates

圖3 間接免疫熒光檢測PRRSV分離株Fig.3 Detection of PRRSV isolate in PAM by indirect immuno fluorescence assay

2.4 GP5基因的克隆和同源性分析 使用GP5基因的特異性引物對GXNN1839進行PCR擴增，目的條帶大小與預期一致（圖4）。測序結(jié)果顯示，該毒株的GP5基因與GenBank上GP5基因的參考序列的同源性為62.0%～93.7%（圖5），與北美病毒株NADC30的同源性最高，為93.1%，與我國分離的NADC30-like病毒株CHsx1401的同源性為91.7%，與VR-2332、CH-1a的同源性分別是87%、86.7%，與高致病性病毒株JXA1的同源性為86.7%，與歐洲株Lelystadvirus（LV）同源性為62.0%。

圖4 PRRSV分離株ORF5基因的PCR擴增Fig.4 Amplification of ORF5 gene of PRRSV isolate by PCR

圖5 GP5核苷酸序列的同源性分析Fig.5 Homology analysis of GP5 nucleotide sequences

2.5 GP5基因的遺傳進化分析 將GXNN1839的GP5基因序列與參考毒株的序列對比，使用Mega6.0軟件構(gòu)建遺傳進化樹（圖6），由結(jié)果可知，PRRSV毒株分為歐洲型和美洲型，其中美洲型PRRSV又主要分為4個譜系（Lineage 1、Lineage 3、Lineage 5和Lineage 8）。該遺傳進化樹表明，GXNN1839與美國毒株NADC30以及中國的NADC30-like毒株同屬于Lineage 1，證明該毒株屬于NADC30-like亞群。2.6 Nsp2基因的擴增及氨基酸對比分析 由于Nsp2蛋白編碼區(qū)是PRRSV中變異最大的區(qū)域，為了探討Nsp2的遺傳變異規(guī)律，我們針對Nsp2的高變區(qū)進行了測序分析。將測序結(jié)果拼接后，利用MegAlign軟件與參考毒株的氨基酸序列進行了對比。結(jié)果顯示，與VR-2332相比，該毒株的Nsp2高變區(qū)共缺失131（111+1+19）個氨基酸（圖7），與2008年美國分離到的NADC30毒株和我國分離的類NADC30（CHsx1401）毒株具有相似的缺失特征，進一步表明GXNN1839屬于類NADC30。

圖6 GXNN1839 GP5核苷酸序列與參考株序列的遺傳進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on GP5 nucleotide sequences of GXNN1839 and reference strains

圖7 NSP2基因的氨基酸序列比對分析Fig.7 Comparison of amino acid sequences of NSP2 gene

3 討論

PRRS是世界養(yǎng)豬業(yè)中的重大傳染病之一，其迅速變異和演化加劇了該病預防和控制難度。2006年，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）在中國豬場暴發(fā)并引起大規(guī)模的死亡[11]。2013年，周峰等[12]分離到了1株Nsp2區(qū)與NADC30毒株Nsp2區(qū)具有相同缺失特征的毒株，命名為NADC30-like。后來，許多學者也通過Marc-145細胞和PAMs分離到了該病毒。鄧躍等[13]通過PAM分離到了NADC30-like，并通過IFA驗證了病毒的存在。對病毒進行體外分離是研究和防治該病毒的前提，而在體外培養(yǎng)時，PRRSV僅能感染豬肺泡巨噬細胞（PAMs）和源于MA-104的幾個亞細胞系（Marc-145、CL2621、HS.2H）。由于PAMs難以獲得且為原代細胞，所以一般情況下，優(yōu)先使用Marc-145細胞對PRRSV進行體外分離。自2013年我國分離到類NADC30以來，目前該毒株已成為我國NADC30-like當前PRRSV優(yōu)勢流行病毒株之一。

NADC30-like易發(fā)生重組，Zhang等[14]對13株NADC30-like的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)有10株屬于重組毒株，且重組斷裂點多發(fā)生在編碼Nsp的基因中。在本次研究中，我們對廣西某發(fā)病豬場采集到的病料進行了RT-PCR檢測，結(jié)果呈PRRSV陽性。將病料樣品接種在PAM細胞上進行病毒的分離，第一代時就出現(xiàn)典型的PRRSV細胞病變（CPE），IFA也驗證N蛋白在細胞中的表達。對毒株的GP5及Nsp2進行序列分析，結(jié)果表明，該分離毒株的GP5基因在遺傳進化樹上與美國毒株NADC30處于同一分支，并且與其同源性最高；Nsp2序列對比表明，該區(qū)域有131（111+1+19）個氨基酸缺失，進一步表明GXNN1839為類NADC30 PRRSV。

近年來，NADC30-like在我國的大面積流行形成了PRRSV毒株多樣化的局面，其變異速度快、易重組的特性造成了該病的防治困難，臨床上正在使用的商業(yè)化疫苗對該類毒株缺乏有效的免疫保護作用。本研究豐富了PRRSV的基因組信息，為研究在我國流行的類NADC30毒株的特性和致病機制奠定了基礎(chǔ)，為廣西地區(qū)的PRRSV防控和該毒株疫苗的研制提供一定的數(shù)據(jù)支持。