魯桂俠

（灤平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，灤平068250）

腸道病毒（Enterovirus，EV）屬于微RNA病毒科腸道病毒屬，對牛、羊、豬及人類均易感[1]，羊感染羊腸道病毒（Caprine enterovirus，CEV）后可引起以嚴重腹瀉、高熱、流涎為主要特征的消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)系列癥狀疫病[2-3]。CEV最早于2012年由Boros等[4]在匈牙利某發(fā)生嚴重腹瀉的綿羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，王明月等[5]于2014年在吉林省某羊場發(fā)生嚴重腹瀉、發(fā)熱、流涎、口腔黏膜潰瘍?yōu)樘卣鞯幕疾∩窖蝮w內(nèi)分離鑒定出我國第1株CEV，同時完成了該分離毒株的基因組測序工作[6]，目前CEV已在我國養(yǎng)羊密集地區(qū)廣泛流行[7]。近年來，隨著河北省肉羊養(yǎng)殖規(guī)模的逐步擴大，羊病毒性腹瀉的發(fā)生率也隨之增加，給河北省肉羊養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失，也在一定程度上阻礙了河北省肉羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。為了掌握河北省部分地區(qū)CEV的感染現(xiàn)狀，有效保護河北省肉羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，本研究采用RT-PCR方法對2017-2019年采集于河北省不同地區(qū)的266份腹瀉羊的糞便樣品進行了CEV感染的病原學(xué)檢測，并對檢測結(jié)果進行了不同地區(qū)、不同年份、不同季節(jié)、不同飼養(yǎng)階段、不同飼養(yǎng)方式的陽性感染率的分析比較，這是國內(nèi)首次針對河北省進行的CEV流行病學(xué)調(diào)查與分析，結(jié)果確定了河北省CEV的感染現(xiàn)狀和流行病學(xué)特點，豐富了我國CEV感染的流行病學(xué)資料，為我國CEV綜合防控措施的制定提供了指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 病毒基因組RNA/DNA提取試劑盒、一步法RT-PCR擴增試劑盒、pMD18-T載體購自日本TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 樣品來源及處理方法 于2017年1月-2019年12月采集臨床中具有明顯腹瀉癥狀的266份腹瀉羊的新鮮糞便樣品，其中在石家莊市采集腹瀉樣本28份，在保定市采集腹瀉樣本34份，在秦皇島市采集腹瀉樣本32份，在承德市采集腹瀉樣本70份，在滄州市采集腹瀉樣本56份，在廊坊市采集腹瀉樣本46份。將采集的新鮮糞便樣品溶解于5倍體積的滅菌生理鹽水中，充分碾磨、混合均勻后，以12 000 ×g離心10 min，吸取的上清液即為處理后的待檢測糞便樣品，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 核酸提取 利用病毒基因組RNA/DNA提取試劑盒依次提取266份臨床腹瀉樣本、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）、綿羊痘病毒（Sheep pox virus，SPV）的核酸。

1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)CEV序列（GenBank登錄號：KU297674.1）5'UTR保守區(qū)設(shè)計1對特異性檢測引物（F：5'-GCAAGGATCGTTACC-3'、R：5'-GTTACGACGTAGCAAC-3'），預(yù)期擴增片段約為300 bp，引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.5 RT-PCR擴增 一步法RT-PCR擴增體系為：2×One Step Buffer 12.5 μL，One Step Enzyme Mix 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，核酸3.0 μL，ddH2O 8.0 μL。一步法RT-PCR擴增程序為：50℃ 30 min；95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，53℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。利用CEV檢測引物依次對提取的CEV、BVDV、PRV、GPV、SPV核酸進行一步法RT-PCR擴增，確定RT-PCR擴增的特異性。利用ddH2O依次對CEV核酸進行10倍倍比稀釋，利用CEV檢測引物依次對不同稀釋度的CEV核酸進行一步法RT-PCR擴增，確定其敏感性。利用CEV檢測引物依次對提取的133份糞便樣品核酸進行一步法RT-PCR擴增，確定臨床腹瀉樣本的檢出率。

1.6 CEV流行特點的比較分析 根據(jù)不同地區(qū)、不同年份、不同季節(jié)、不同飼養(yǎng)階段、不同飼養(yǎng)方式等條件對266份腹瀉樣本的RT-PCR擴增結(jié)果進行比較分析，確定河北省CEV的流行病學(xué)特點。

2 結(jié)果與討論

2.1 RT-PCR方法的特異性和敏感性結(jié)果 利用CEV檢測引物依次對提取的CEV、BVDV、PRV、GPV、SPV核酸進行一步法RT-PCR擴增，結(jié)果只有CEV擴增出約300 bp的特異性條帶，與預(yù)期相符，而BVDV、PRV、GPV、SPV擴增結(jié)果均為陰性，RT-PCR方法具有良好的特異性。利用CEV檢測引物依次對不同稀釋度的CEV核酸進行一步法RT-PCR擴增，結(jié)果表明可以檢測到10-4稀釋的RNA模板，具有良好的敏感性。以上結(jié)果說明該RTPCR方法完全可以應(yīng)用于臨床中CEV感染的快速診斷和流行病學(xué)監(jiān)測。

圖1 RT-PCR方法的特異性Fig.1 Specificity of RT-PCR

圖2 RT-PCR方法的敏感性Fig.2 Sensitivity of RT-PCR

2.2 臨床樣本的RT-PCR擴增結(jié)果 自2016年王明月等[5]報道我國發(fā)現(xiàn)首株CEV后，我國研究學(xué)者高度重視國內(nèi)CEV的流行情況，陸續(xù)進行了不同地區(qū)CEV感染的流行病學(xué)監(jiān)測。王汝都等[8]采用雙抗體夾心ELISA方法對2015-2018年采集于河南省的1074份羊腸道或糞便樣品進行CEV感染的病原學(xué)檢測，其平均陽性感染率為19.93%。李欣等[9]采用夾心ELISA方法對山東省內(nèi)的182份綿羊和山羊糞便樣品進行了CEV感染的流行病學(xué)檢測，綿羊和山羊CEV陽性感染率分別為58.67%和48.60%，山東省內(nèi)CEV平均陽性感染率為52.75%。魯海冰等[10]采用夾心ELISA方法對吉林和內(nèi)蒙古不同羊場的432份羊糞便樣品進行了CEV感染的病原學(xué)檢測，吉林和內(nèi)蒙古不同市區(qū)羊群CEV陽性感染率介于11.40%～100.0%，CEV平均陽性感染率為49.77%。張群等[11]采用夾心ELISA方法分別對吉林省208份羊糞便樣品和內(nèi)蒙古地區(qū)959份羊糞便樣品進行了CEV感染的病原學(xué)檢測，吉林省和內(nèi)蒙古CEV平均陽性感染率分別為83.17%和59.12%。本研究采用RT-PCR方法對2017-2019年采集于河北省部分地區(qū)的266份羊糞便樣品進行了CEV感染的病原學(xué)檢測，共檢測出CEV陽性樣品74份（部分樣品的RT-PCR擴增結(jié)果見圖3），CEV陽性感染率達27.82%。以上流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，我國羊群中CEV陽性感染率在不同地區(qū)各有不同，且在部分地區(qū)CEV陽性感染率較高，個別地區(qū)CEV感染情況較嚴重，加強CEV的綜合防控措施已迫在眉睫。本研究中河北省CEV平均陽性感染率顯著低于李欣[9]、魯海冰[10]、張群等[11]流行病學(xué)調(diào)查的CEV陽性感染率，表明相對于國內(nèi)其他地區(qū)，河北省CEV陽性流行情況尚處于較低的發(fā)病水平，只要加強綜合防控措施可以有效控制該疾病的發(fā)生與傳播。

圖3 部分樣品RT-PCR擴增結(jié)果Fig.3 RT-PCR results of some samples

2.3 CEV流行特點的比較分析結(jié)果 CEV作為一種新發(fā)傳染病，其流行特點尚不明確。為了全面掌握CEV的流行特點，本研究將266份糞便樣品的CEV病原學(xué)檢測結(jié)果進行了不同地區(qū)、不同年份、不同季節(jié)、不同飼養(yǎng)階段、不同飼養(yǎng)方式等條件進行比較分析。通過對不同地區(qū)樣品的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析（表1）可知，河北省不同地區(qū)均存在不同程度的CEV感染，其中以承德市的感染率最高（37.14%），滄州市次之（35.71%），石家莊市感染率較低（14.29%）。通過對不同年份的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析（表2）可知，2017-2019年CEV陽性感染率分別為21.62%、26.67%、33.33%，2018年較2017年增長了5.05%，2019年較2017年、2018年分別增長了11.71%、6.66%，表明CEV在河北省的感染存在逐年嚴重的趨勢。通過對不同季節(jié)的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析（表3）可知，不同季節(jié)對CEV陽性感染率的影響較大，秋季CEV陽性感染率最高（34.09%），春季次之（32.43%），夏季和冬季的CEV陽性感染率相對較低，分別為14.29%和22.58%。通過對羊不同飼養(yǎng)階段的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析（表4）可知，不同飼養(yǎng)階段對CEV陽性感染率的影響較大，羔羊CEV陽性感染率最高（37.29%），育肥羊和后備種羊的陽性感染率相對較低，分別為14.26%和15.79%。通過對羊不同飼養(yǎng)方式的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析（表5）可知，不同飼養(yǎng)方式對CEV陽性感染率的影響較大，圈養(yǎng)方式下CEV陽性感染率最高（35.94%），散養(yǎng)方式下CEV陽性感染率最低（15.38%）。以上流行特點統(tǒng)計分析表明，不同地區(qū)羊群中均存在不同程度的CEV感染，個別地區(qū)感染情況較嚴重；不同年份羊群中CEV陽性感染率差異較大，CEV的感染存在逐年嚴重的趨勢；不同季節(jié)對CEV陽性感染率的影響較大，秋季和春季相對于夏季和冬季更容易感染CEV；不同飼養(yǎng)階段對CEV陽性感染率的影響較大，羔羊相對于育肥羊和后備種羊更容易感染CEV；不同飼養(yǎng)方式對CEV陽性感染率的影響較大，圈養(yǎng)方式相對于散養(yǎng)方式更容易感染CEV。通過對不同地區(qū)、不同年份、不同季節(jié)、不同飼養(yǎng)階段、不同飼養(yǎng)方式的比較分析，掌握了河北省CEV的流行特點，豐富了河北省CEV流行病學(xué)資料，為河北省乃至全國CEV綜合防控措施的制定提供了理論支持。

表1 不同地區(qū)的檢測結(jié)果Table 1 The results of di ff erent regions

表2 不同年份的檢測結(jié)果Table 2 The results of di ff erent years

表3 不同季節(jié)的檢測結(jié)果Table 3 The results of di ff erent seasons

表4 不同飼養(yǎng)階段的檢測結(jié)果Table 4 The results of di ff erent feeding stages

表5 不同飼養(yǎng)方式的檢測結(jié)果Table 5 The results of di ff erent feeding methods