田美媛，張耀剛，李志琴，樊海寧，侯 靜，李建華，黃登亮，孫 莉，江 源，童思賢，張文詩，馬艷艷,

（1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西寧810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院科研管理部，西寧810001；3.青海省包蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810001）

細(xì)粒棘球蚴（Echinococcus granulosus，Eg）在分類學(xué)上隸屬于扁形動(dòng)物門（Platyhelminthes）、絳蟲綱（Class Cestoda）、圓葉目（Cyclophyllidea）、帶科（Taeinidae）、棘球亞科（EehinoeoeeinaeAbuladse）、棘球?qū)伲‥chinococcus），廣泛分布于世界各地[1]。機(jī)體感染細(xì)粒棘球蚴的幼蟲可引發(fā)囊型包蟲?。╟ystic echinococcosis），嚴(yán)重影響人類、牲畜和野生動(dòng)物的健康，是很多國(guó)家主要的公共衛(wèi)生安全問題之一，造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。安全、無污染、有效地防治細(xì)粒棘球絳蟲已成為人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的問題，開發(fā)新型防治制劑也成為必然趨勢(shì)，這種方法的關(guān)鍵在于識(shí)別包蟲的功能分子[3-4]?，F(xiàn)有研究顯示，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（fatty acid transport protein，F(xiàn)ATP）在生物合成過程、膜構(gòu)建、能量穩(wěn)態(tài)、大腦發(fā)育、中風(fēng)和胰島素抵抗中具有重要作用[5-6]。

根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)外源性脂肪酸的能力，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATP）被歸入溶質(zhì)載體27（SLC27）家族。長(zhǎng)鏈脂肪酸（long chain fatty acids，LCFAs）是人體的主要能量來源之一，在磷脂和鞘脂等結(jié)構(gòu)性脂類的合成以及蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾中發(fā)揮作用[7]。此外，LCFAs可以通過改變二十烷類化合物的合成和激活toll樣受體來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。LCFA需要通過細(xì)胞膜上的蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)才能通過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，例如脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase/CD36，F(xiàn)AT/CD36），長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶CoA合成酶（longchain fatty acyl -coenzyme A (CoA) synthetase，LACS）和FATPs）等[8]。細(xì)粒棘球蚴的生長(zhǎng)和維持對(duì)宿主脂質(zhì)有很高的要求[9]。

從單細(xì)胞生物體到人類，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是涉及脂肪酸吸收和激活的蛋白質(zhì)家族，在能量穩(wěn)態(tài)、生熱和胰島素抵抗中具有重要作用。目前在人類及鼠的基因組FATPs家族中已確定的有6種類型（FATP1-6），其在哺乳動(dòng)物中具有不同的組織定位及功能[10]。脂肪酸在進(jìn)入細(xì)胞后，必須穿過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到被利用的部位，細(xì)胞外空間的游離脂肪酸濃度通常極低[11]。因此，長(zhǎng)鏈脂肪酸的高效轉(zhuǎn)運(yùn)需要特定的膜結(jié)合和膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來對(duì)抗?jié)舛忍荻确e累這些化合物。FATPs作為一種多功能載體蛋白，具有參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝的作用[12]。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以介導(dǎo)脂肪酸的攝取以及使用長(zhǎng)鏈和超長(zhǎng)鏈脂肪酸，膽汁酸和膽汁酸前體作為底物來催化輔酶A衍生物的形成[13]。但關(guān)于細(xì)粒棘球蚴脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究較少，其在細(xì)粒棘球蚴體內(nèi)具體作用機(jī)制不明。因此，弄清細(xì)粒棘球蚴脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)特征對(duì)于該病原所造成的疾病的防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 序列獲取 本研究所涉及的FATP氨基酸序列均來自于GenBank（GenBank登錄號(hào)：EUB64139.1）和BLAST分析得到Eg-FATP基因序列，利用Eg-FATP基因CDS翻譯的氨基酸序列進(jìn)行分析。

1.2 Eg-FATP蛋白的生物信息學(xué)分析 使用ExPASy系統(tǒng)的ProtParam程序分析Eg-FATP的理化性質(zhì)，應(yīng)用ProtScale程序基于KyteDoolittle算法分析疏水性；用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/分析該序列可能具有的磷酸化位點(diǎn)等特性；使用DNAStar軟件分別采用Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Jameson-Wolf、Plot-Emini算法分析親水性、柔性區(qū)域、抗原性指數(shù)、表面可及性；利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線程序預(yù)測(cè)分析Eg-FATP蛋白的信號(hào)肽；應(yīng)用Euk-mPLoc 2.0 server（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；使用GO R4軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用Phyre2 軟件（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）模擬蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；用IEDB在線軟件（http://tools.iedb.org./bcell/）預(yù)測(cè)B細(xì)胞線性表位，運(yùn)用SYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/bin/mhc server.dll/epitope prediction.htm）分析T細(xì)胞表位，通過DNAMAN軟件多重比對(duì)FATP在不同物種間的同一性，通過TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件預(yù)測(cè)跨膜區(qū)，通過MEGA 4.0軟件構(gòu)建Eg-FATP分子進(jìn)化樹，使用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建Eg-FATP互作網(wǎng)絡(luò)、GO注釋和KEGG分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料 Trizol購自寶生物工程（大連）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Eg-FATP基因引物（上游：5'-TCCATGTATC GTCGAAGCCG-3'，下游：5'-GACGAACTTTGTG CTGCGTT-3'），內(nèi)參β-actin（上游：5'-CTGC AAGCTGTTCTAGCCCT-3'、下游：5'-CACTTGTG GTTTCTGCACGG-3'），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 標(biāo)本收集 細(xì)粒棘球蚴原頭蚴、包囊均采自青海省西寧市湟中縣魯沙爾鎮(zhèn)牛羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)羊肝臟。原頭蚴分離：無菌條件下抽取肝臟包囊內(nèi)囊液，待原頭蚴自然下沉后棄去上清液，用含有青鏈霉素的生理鹽水反復(fù)清洗原頭蚴備用。

1.5 Eg-FATP基因表達(dá)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組為原頭蚴組和包囊壁組，采用Trizol法提取總RNA，超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度。取1.5 g高質(zhì)量（OD260/OD280=1.8-2.1）總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋3倍，取2 μL作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以滅菌ddH2O為無模板對(duì)照，使用不經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的總RNA作為模板檢測(cè)基因組DNA污染。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性60 s，60℃退火延伸34 s（本步驟采集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。qPCR數(shù)值分析采用2－ΔΔCt分析法，利用Graph pad8.0作圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 24.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，統(tǒng)計(jì)推斷中，兩組間的差異通過兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，如果組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用Bonferroni法進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 Eg-FATP氨基酸序列 Eg-FATP基因由1個(gè)外顯子構(gòu)成，無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，CDS長(zhǎng)度為1539 bp，編碼512個(gè)氨基酸，細(xì)粒棘球蚴脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有1個(gè)開放閱讀框。

2.2 理化性質(zhì)預(yù)測(cè) ProtParam程序分析顯示，Eg-FATP分子式為C2541H3997N681O744S12，分子質(zhì)量56 375.52，等電點(diǎn)PI為8.04；半衰期為30 h（mammalian reticulocytes，in vitro）、>20 h（yeast，in vivo）、>10 h（Escherichia coli，in vivo），不穩(wěn)定指數(shù)為27.39的穩(wěn)定蛋白。

2.3 疏水性預(yù)測(cè) ProtScale程序預(yù)測(cè)Eg-FATP的疏水性分布情況，對(duì)分子質(zhì)量、密碼子數(shù)目、膨脹度、極性、折射系數(shù)及識(shí)別因子等參數(shù)采用系統(tǒng)默認(rèn)值，其值在-2.5～2.5之間，疏水圖譜中正值與疏水性成正比，負(fù)值與親水性成正比，表明Eg-FATP既有疏水性區(qū)域，又有親水性區(qū)域，易折疊構(gòu)成跨膜蛋白（圖1）。

圖1 應(yīng)用ProtScale構(gòu)建的Eg-FATP疏水圖譜Fig.1 Hydrophobic map built by ProtScale software

2.4 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) NetPhos預(yù)測(cè)該蛋白磷酸化位點(diǎn)包括24個(gè)絲氨酸、8個(gè)酪氨酸和15個(gè)蘇氨酸（圖2）。

圖2 Eg-FATP ORF磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 The phosphorylation sites of Eg-FATP ORF were predicted

2.5 親水性、柔性區(qū)域、抗原性指數(shù)、表面可及性分析 用Karplus-Schulz方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性，可知蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性區(qū)段有33個(gè)；以Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)Eg-FATP蛋白潛在的抗原決定簇，Eg-FATP蛋白抗原指數(shù)高的區(qū)域較多。Eg-FATP蛋白的表面可及性和親水性結(jié)果顯示，抗原指數(shù)高的區(qū)域其親水性和表面的可及性一致性較高（圖3）。蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象可以使存在于蛋白表面的親水殘基和溶液中的極性分子結(jié)合，從而中和蛋白質(zhì)電荷，使蛋白質(zhì)保持最小能量。因此，親水性區(qū)域與抗原表位有關(guān)。因此，B細(xì)胞表位（抗體表位）優(yōu)勢(shì)區(qū)域可能就是展示在蛋白表面的可及區(qū)域[14]。

圖3 Eg-FATP的親水性、柔性區(qū)域、抗原性指數(shù)、表面可及性預(yù)測(cè)Fig.3 Hydrophilicity，fiexible regions，antigenic index，surfase probability of Eg-FATP predicted

2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 應(yīng)用SOMPA軟件預(yù)測(cè)Eg-FATP二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占氨基酸總數(shù)的33.2%（藍(lán)色），延長(zhǎng)鏈占22.7%（紅色），β轉(zhuǎn)角占7.03%（綠色），無規(guī)則卷曲占37.70%（橘黃色），主要以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，具有良好的穩(wěn)定性，且為親水性蛋白（圖4）。

圖4 Eg-FATP蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.4 Secondary structure of Eg-FATP protein predicted

2.7 B細(xì)胞線性表位和T細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 通過IEDB軟件預(yù)測(cè)Eg-FATP B細(xì)胞線性表位，為提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，軟件預(yù)測(cè)結(jié)果中只保留長(zhǎng)度＞7的結(jié)果，可能形成B細(xì)胞線性表位的氨基酸序列為37-48、144-158、171-185、219-227、258-275、295-305、340-346、389-395、415-423、439-455（圖5）。采用SYFPEITHIF分析HLA-A*02-01，以23為臨界分值，Eg-FATP有14個(gè)CTL細(xì)胞表位（表1）；采用SYFPEITHIF分析HLA-DRB1*0401，發(fā)現(xiàn)Eg-FATP無Th細(xì)胞表位?？乖ㄟ^抗原表位與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答；抗原借表位與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)。抗原表位的性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)型決定抗原的特異性[15]；Eg-FATP有10個(gè)潛在的B細(xì)胞線性表位和14個(gè)潛在的CTL細(xì)胞表位，表明用其免疫動(dòng)物能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答[16-17]。

表1 SYFPEITHIF軟件預(yù)測(cè)的Eg-FATP T細(xì)胞抗原表位Table 1 T cell epitopes predicted by SYFPEITHIF software

圖5 IEDB軟件預(yù)測(cè)的Eg-FATP B細(xì)胞線性表位Fig.5 B cell linear epitopes predicted by IEDB software

2.8 信號(hào)肽分析及亞細(xì)胞定位 通過SingalP程序分析Eg-FATP無信號(hào)肽可能為非跨膜蛋白，提示Eg-FATP為非分泌蛋白，不參與信號(hào)傳導(dǎo)作用（圖6）。應(yīng)用Euk-mPLoc 2.0 server軟件預(yù)測(cè)Eg-FATP定位于細(xì)胞質(zhì)，在脂肪細(xì)胞中，胰島素通過mTORC1信號(hào)通路誘導(dǎo)SLC27A1快速從細(xì)胞間室轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，同時(shí)增加LCFA攝取。

圖6 應(yīng)用SingalP程序分析Eg-FATP的信號(hào)肽Fig.6 Singal Peptide of Eg-FATP analysed by SingalP program

2.9 三級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)分析 通過SWISS-MODEL網(wǎng)站預(yù)測(cè)Eg-FATP的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果展示出蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，為了解該蛋白質(zhì)的特性，進(jìn)而為研制疫苗和藥物作用位點(diǎn)預(yù)測(cè)等提供理論依據(jù)（圖7）。TMHMM軟件預(yù)測(cè)Eg-FATP無跨膜區(qū)域，蛋白全部在膜外，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建能為表位抗原的設(shè)計(jì)和目的蛋白的篩選等提供理論依據(jù)，本研究構(gòu)建的Eg-FATP三級(jí)結(jié)構(gòu)與人類FATP的相似度是93%（圖8）。

圖7 應(yīng)用Phyre2軟件構(gòu)建的Eg-FATP三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Tertiary structure of Eg-FATP built by Phyre2 Software

圖8 TMHMM軟件預(yù)測(cè)的Eg-FATP跨膜區(qū)Fig.8 Transmembrane domains of Eg-FATP predicted by TMHMM software

2.10 Eg-FATP蛋白進(jìn)化樹分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中細(xì)粒棘球蚴脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中國(guó)株DNA序列與細(xì)粒棘球蚴英國(guó)株DNA序列、多房棘球蚴（Echinococcus multilocularis）、小口膜殼絳蟲（Hymenolepis microstoma）、華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）、日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）、二斑葉螨（Tetranychus urticae）的FATP DNA序列，通過MEGA 4.0構(gòu)建的Eg-FATP蛋白的分子進(jìn)化樹（圖9）。細(xì)粒棘球蚴的FATP蛋白與多房棘球蚴親緣關(guān)系較近，與二斑葉螨親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，細(xì)粒棘球蚴中國(guó)株和英國(guó)株的氨基酸序列同一性較高，為97%左右，說明細(xì)粒棘球蚴FATP蛋白較為保守，可能在機(jī)體的生命過程中發(fā)揮著重要的生理功能。找到Eg-FATP的特有序列，結(jié)合其表位序列可為表位抗原的設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)[18]。

圖9 細(xì)粒棘球蚴FATP進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of Eg-FATP

2.11 Eg-FATP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建Eg-FATP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖10），與該基因有關(guān)的基因本體論（GO）注釋和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，Eg-FATP對(duì)長(zhǎng)鏈和超長(zhǎng)鏈脂肪酸具有酰基輔酶A連接酶活性。作為真正的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在細(xì)胞質(zhì)或膜相關(guān)的多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物中發(fā)揮作用，以捕獲并吸引脂肪酸蓄積。Eg-FATP蛋白可能參與膽固醇代謝的調(diào)節(jié)和脂肪酸跨血屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)，提示該基因在候選疫苗基因方面有著很好的應(yīng)用前景[19-20]。

圖10 細(xì)粒棘球蚴FATP互作網(wǎng)絡(luò)Fig.10 Protein interaction network of Eg-FATP

2.12 Eg-FATP基因在細(xì)粒棘球蚴原頭蚴和包囊壁表達(dá)分析 以原頭蚴組作為對(duì)照組qPCR擴(kuò)增Eg-FATP基因結(jié)果可知，Eg-FATP基因在細(xì)粒棘球蚴原頭蚴和包囊壁均有轉(zhuǎn)錄，且在原頭蚴階段轉(zhuǎn)錄水平較高差異顯著（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖11），提示Eg-FATP在細(xì)粒棘球蚴的原頭蚴和包囊中均發(fā)揮重要作用。綜上所述，Eg-FATP蛋白可能對(duì)細(xì)粒棘球蚴的膽固醇代謝有重要的調(diào)節(jié)作用，且其具有多個(gè)B細(xì)胞及T細(xì)胞抗原表位，抗原性良好，可為抗細(xì)粒棘球蚴新藥的開發(fā)、疫苗的研制及免疫診斷等提供理論依據(jù)。

圖11 Eg-FATP基因在細(xì)粒棘球蚴原頭蚴和包囊壁的差異表達(dá)Fig.11 Di ff erential transcription of FATP in protocercariae and cyst wall of Echinococcus granulosus