肖夢(mèng)珂，賈巖龍

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是一種以早期肺泡炎癥、晚期成纖維細(xì)胞異常增生轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)大量沉積等為特征的肺間質(zhì)性疾病[1]。PF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并且無特異臨床表現(xiàn)，早期診斷比較困難；PF作為一種病因不明的慢性進(jìn)行性肺疾病，無法治愈，確診后的中位生存時(shí)間只有2～3 a[2]。同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)分析具有高通量設(shè)置、高靈敏度和高準(zhǔn)確性等顯著優(yōu)勢(shì)，目前已成為一種強(qiáng)大的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法[3]。iTRAQ技術(shù)已被廣泛用于各種差異蛋白的研究，如胃癌中人血清差異表達(dá)的蛋白人血清、結(jié)核分枝桿菌、小鼠急性肺損傷等[4-6]。近些年來，PF的研究取得了重大進(jìn)步，確定了一些細(xì)胞因子在PF發(fā)生、發(fā)展中的作用，但是這些作用并不能完全解釋PF發(fā)病中的所有現(xiàn)象[7]。因此，從整體水平加強(qiáng)對(duì)PF發(fā)病機(jī)制的研究，明確其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上確定新的治療策略就成為非常迫切的現(xiàn)實(shí)需要。

在以肺部炎癥和進(jìn)行性纖維化為特征的肺部疾病影響著數(shù)千萬長(zhǎng)期在粉塵環(huán)境中工作的人，肺內(nèi)晶體二氧化硅的吞噬引起溶酶體損傷，激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥小體，觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)，隨后發(fā)生纖維化[8]。百草枯是一種水溶性有機(jī)雜環(huán)化合物，一般作為強(qiáng)效除草劑使用，可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞損傷，甚至死亡。隨著肺泡細(xì)胞的破壞，肺毛細(xì)血管進(jìn)一步破裂導(dǎo)致肺泡內(nèi)出血和肺部感染。最后，PF可發(fā)生在肺泡ECM的肺細(xì)胞周圍，這種情況稱為“百草枯肺”[9]。博萊霉素是一種水溶性糖肽類抗生素。博萊霉素注入人體后，分布到機(jī)體各組織器官中，因?yàn)榉魏推つw細(xì)胞的酰胺酶活性低，所以含量較高，博萊霉素水解失活少，常蓄積導(dǎo)致不良反應(yīng)，故成為誘導(dǎo)動(dòng)物PF模型的常用藥物之一[10]。雖然3種模型的損傷機(jī)制不同，但相關(guān)細(xì)胞因子的病理變化、過程及其分子調(diào)控機(jī)制與人PF相似。因此，本論文構(gòu)建二氧化硅、百草枯、博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠PF模型，采用iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS質(zhì)譜分析，整體分析3種大鼠PF模型與正常肺組織之間的共同差異表達(dá)蛋白，以期尋找與PF相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。研究發(fā)現(xiàn)將為闡明PF形成機(jī)制奠定重要的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為PF的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 大鼠PF模型建立方法隨機(jī)選取48只SD大鼠(購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，分為6組：二氧化硅模型組(n=8)和二氧化硅對(duì)照組(n=8)：二氧化硅模型組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(0.3 mL/kg)麻醉大鼠，于氣管軟骨環(huán)間隙穿刺，每只大鼠注入二氧化硅懸液0.2～0.3 mL(5 mg/kg)；百草枯模型組(n=8)和百草枯對(duì)照組(n=8)：百草枯模型組大鼠一次性給予百草枯50 mg/kg灌胃染毒造模；博萊霉素模型組(n=8)和博萊霉素對(duì)照組(n=8)：博萊霉素模型組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(0.3 mL/kg)麻醉大鼠，于氣管軟骨環(huán)間隙穿刺，每只大鼠注入鹽酸博萊霉素5 mg/kg；3個(gè)對(duì)照組分別以與相應(yīng)模型組相同方法注射或灌胃相同體積生理鹽水。待動(dòng)物自然清醒后進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。各組大鼠在給藥后第28天處死，完整分離每只大鼠的雙側(cè)肺組織樣品。

1.2 肺系數(shù)計(jì)算及羥脯氨酸含量測(cè)定方法將分離得到的大鼠雙側(cè)肺組織用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸除肺組織樣品表面的水分，稱量肺濕質(zhì)量。肺系數(shù)計(jì)算公式：肺系數(shù)=肺濕質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。取右肺中葉組織稱重，剪碎后冰浴中勻漿，用羥脯氨酸試劑盒(購自南京建成生物公司)測(cè)定肺組織樣品中羥脯氨酸含量，測(cè)定方法按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 肽段酶解及標(biāo)記方法提取肺組織蛋白樣品定量后分別取200 μg蛋白溶液置于離心管中，用iTRAQ試劑盒(美國(guó)AB Sciex公司)進(jìn)行酶解，酶解后的肽段樣品用四標(biāo)iTRAQ試劑盒(美國(guó)AB Sciex公司)進(jìn)行標(biāo)記。為了確保標(biāo)記的效率及定量準(zhǔn)確性，從6組樣品中各取出1 μL混合用于檢測(cè)，先用Ziptip進(jìn)行樣品脫鹽處理，再用MALDI-TOF-TOF進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，然后將標(biāo)記的樣品真空干燥儲(chǔ)存。

1.4 肽段離線預(yù)分離及蛋白質(zhì)分析在色譜柱(Durashell-C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm, 100 ?)中加入酶解好的牛血清白蛋白400 μg進(jìn)行分離(柱溫45 ℃)，檢測(cè)系統(tǒng)的運(yùn)行狀況(檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm)。在上述酶解標(biāo)記的肽段混合樣品中加入100 μL流動(dòng)相A[98%雙蒸水、體積分?jǐn)?shù)2%乙腈(pH 10.0)]充分溶解，14 000 g離心20 min，取100 μL上清樣本上樣，流速為0.7 mL/min。預(yù)分離的蛋白肽段樣品組分應(yīng)用高效液相色譜儀和質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。分離梯度設(shè)置見表1。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析方法本研究iTRAQ質(zhì)譜分析產(chǎn)生的原始文件采用美國(guó)Thermo公司的配套軟件Proteome Discoverer 1.3處理。根據(jù)原始數(shù)據(jù)的P值，選取P≤0.05進(jìn)行過濾，分別在二氧化硅組、百草枯組、博萊霉素組上下調(diào)差異倍數(shù)≥1.5中，尋找3種PF模型同時(shí)上調(diào)和下調(diào)所得蛋白列表進(jìn)行進(jìn)一步生物信息學(xué)分析。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的生物學(xué)功能注釋，獲取與差異表達(dá)蛋白質(zhì)所有相關(guān)的功能信息。

表1 蛋白肽段分離梯度設(shè)置

2 結(jié)果

2.1 大鼠PF模型的復(fù)制及造模評(píng)估結(jié)果本研究分別建立了二氧化硅、百草枯、博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠PF模型。與相應(yīng)對(duì)照組比較，3個(gè)模型組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡腔多發(fā)生塌陷，肺泡間隔顯著增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，膠原沉積及大量纖維組織增生。與相應(yīng)對(duì)照組比較，3個(gè)模型組肺組織樣品多呈3級(jí)纖維化和2級(jí)肺泡炎改變，肺泡炎評(píng)分顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t二氧化硅組=43.929，P<0.001；t百草枯組=44.507，P<0.001；t博萊霉素組=32.156，P<0.001)。與相應(yīng)對(duì)照組比較，3個(gè)模型組的PF評(píng)分也明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t二氧化硅組=51.479，P<0.001；t百草枯組=47.591，P<0.001；t博萊霉素組=43.453，P<0.001)。與相應(yīng)對(duì)照組比較，3個(gè)模型組大鼠肺系數(shù)明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t二氧化硅組=58.016，P<0.001；t百草枯組=61.497，P<0.001；t博萊霉素組=24.093，P<0.001)。與相應(yīng)對(duì)照組比較，3個(gè)模型組大鼠肺組織羥脯氨酸含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t二氧化硅組=12.759，P<0.001；t百草枯組=3.770，P=0.001；t博萊霉素組=7.131，P<0.001)。見圖1，表2、3。

2.2 肽段的質(zhì)量準(zhǔn)確度評(píng)估結(jié)果在全掃描范圍內(nèi)，大部分的離子偏差值都在±10 ppm范圍內(nèi)，測(cè)得的肽段質(zhì)量數(shù)據(jù)偏差較小且穩(wěn)定，說明了儀器測(cè)定的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確度都較高。如質(zhì)荷比大部分分布在350～1 200，肽段存在的形式多以2+、3+和4+電荷及以上，肽段相對(duì)分子質(zhì)量分布在1 000～2 500，表明樣品酶解效果好，儀器能測(cè)定大多數(shù)的肽段信息。

2.3 3種PF模型蛋白差異表達(dá)譜本研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對(duì)二氧化硅、百草枯、博萊霉素所致大鼠PF模型進(jìn)行了蛋白組學(xué)研究。經(jīng)過iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定，由統(tǒng)計(jì)圖的各點(diǎn)進(jìn)行定量分析后，根據(jù)其在114(對(duì)照組)、115(二氧化硅模型組)、116(百草枯模型組)、l17(博萊霉素模型組)標(biāo)簽峰的峰面積比值，我們選取了以114作為對(duì)照，115、116、117與之進(jìn)行比較。根據(jù)原始數(shù)據(jù)的P值，選取P≤0.05進(jìn)行過濾，分別在二氧化硅組、百草枯組、博萊霉素組上下調(diào)差異倍數(shù)≥1.5中，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析。3種模型的差異蛋白比較發(fā)現(xiàn)，共同的差異表達(dá)蛋白有57個(gè)，其中上調(diào)蛋白21個(gè)，下調(diào)蛋白36個(gè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表4。

圖1 3種大鼠PF模型肺組織HE染色鑒定結(jié)果圖

表2 3種大鼠PF模型肺泡炎與PF評(píng)分比較

表3 二氧化硅、百草枯、博萊霉素PF模型肺系數(shù)及羥脯氨酸含量

表4 3種大鼠PF模型的差異蛋白比較

續(xù)表4

續(xù)表4

3 討論

PF是由多種肺部損傷引起的，包括毒性、自身免疫性、藥物誘導(dǎo)、感染性或創(chuàng)傷性損傷。PF形成的誘因和病理是由于ECM過度沉積，ECM的主要成分是膠原蛋白，而羥脯氨酸作為膠原蛋白中一種特有的氨基酸，當(dāng)膠原蛋白代謝發(fā)生異常時(shí)，組織內(nèi)羥脯氨酸含量會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[7]，因此肺組織肺系數(shù)和羥脯氨酸含量結(jié)果可以證明二氧化硅、百草枯和博萊霉素PF造模成功與否。本研究運(yùn)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，二氧化硅、百草枯、博萊霉素PF模型之間的共同的差異蛋白有57個(gè)，其中上調(diào)蛋白21個(gè)，下調(diào)蛋白36個(gè)。并發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要與ECM受體相互作用，如發(fā)現(xiàn)整合素3、凝血酶敏感蛋白1表達(dá)改變都與ECM沉積有關(guān)，這也證明了PF過程主要為ECM沉積所致。另外，對(duì)于溶酶體通路富集，組織蛋白酶Z、組織蛋白酶S等與溶酶體相關(guān)蛋白大量表達(dá)，說明PF過程與肺泡炎相關(guān)。如果能消除炎性介質(zhì)，穩(wěn)定溶酶體，減少炎性細(xì)胞因子的釋放可能對(duì)肺損傷有保護(hù)作用，也有利于延緩PF發(fā)生、發(fā)展過程。肺泡巨噬細(xì)胞分泌的血小板衍生生長(zhǎng)因子以及血小板的激活對(duì)肺纖維化多種病理病變過程有著重要影響，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在差異表達(dá)蛋白中血小板糖蛋白Ⅰb α鏈前體、血小板糖蛋白Ⅰb β鏈前體、血小板堿性蛋白前體、血小板因子4前體、血小板糖蛋白VX1亞型、血小板糖蛋白IX前體均參與肺纖維化形成。另外，這些差異蛋白也與細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)，如多肽5樣亞型X11、X5等；也可能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，如糖蛋白、載脂蛋白等。研究[11-12]表明，血紅素氧合酶1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子均參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡以及新生血管生成等細(xì)胞過程，可作為腫瘤標(biāo)志物。除了本研究中不同PF模型組中檢測(cè)到的差異蛋白，后續(xù)可以研究一些腫瘤相關(guān)標(biāo)志物是否也可以作為肺纖維化的檢測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，本研究采用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)篩選出3種PF模型中多個(gè)差異表達(dá)蛋白，為深入探討PF的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究方向。