米 陽，任飛飛，劉 斌，于 泳，黃 煌，梅 璐，鄭鵬遠

(馬歇爾醫(yī)學研究中心、鄭州大學第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第5位，病死率居第3位的惡性腫瘤[1]。胃癌以腺癌為主，又可細分為腸型和彌漫型[2]。飲食因素、吸煙、幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)病的主要原因[3]。胃癌的發(fā)生是多階段的過程，涉及原癌基因的激活、抑癌基因失活、端粒酶激活以及凋亡相關(guān)基因的異常表達等[4-5]。由于早期胃癌很少出現(xiàn)癥狀，因此絕大多數(shù)患者診斷時病程已經(jīng)處于晚期；除此之外，高轉(zhuǎn)移率和腫瘤復(fù)發(fā)等特性，也使得胃癌患者往往預(yù)后較差[6]，在大多數(shù)國家，5 a存活率在20%～40%之間[7]。因此，迫切需要尋求新的生物標志物來診斷和治療胃癌。

近年來，高通量測序及基因芯片技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種生物醫(yī)學領(lǐng)域，如探究腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵標志物和信號通路；通過對多個疾病基因的臨床測序，可以有效預(yù)防各類疾病的產(chǎn)生；耐藥性基因突變的檢測；轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究等。基于此，本研究通過分析多種數(shù)據(jù)庫中胃癌的測序數(shù)據(jù)集，來分析同源盒基因C9(homeobox C9, HOXC9)基因在胃癌發(fā)病進程中的意義及其對胃癌患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫資料收集分析利用TIMER(http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/)、Fire Browse(http: // firebrowse.org/)數(shù)據(jù)庫分析HOXC9在各種腫瘤中的表達情況。利用Oncomine(https://www.oncomine.org)、基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA；http://gepia.cancer-pku.cn/)、腫瘤基因組圖譜計劃(the cancer genome atlas，TCGA；https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics /tcga)以及基因表達匯編(Gene Expression Omnibus, GEO；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫分析胃癌組織和正常人胃黏膜中HOXC9的表達情況。其中，TCGA數(shù)據(jù)庫中下載胃癌的基因表達值數(shù)據(jù)，進行標準化處理后，分析384例胃癌患者和37例健康人胃黏膜中HOXC9的表達數(shù)據(jù)。通過Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)數(shù)據(jù)庫分析幽門螺桿菌感染與未感染組織樣本HOXC9基因表達情況。利用Kaplan-Meier (www.kmplot.com) 數(shù)據(jù)庫分析HOXC9表達與胃癌患者預(yù)后關(guān)系。通過 cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)數(shù)據(jù)庫獲取胃癌組織中與HOXC9共表達的基因，并利用R軟件包分析與HOXC9相關(guān)性最高的基因。

1.2 GEO數(shù)據(jù)庫基因芯片數(shù)據(jù)來源從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE65801與GSE54129的基因表達數(shù)據(jù)，GSE65801是基于GPL14550平臺的32例胃癌組織與配對的正常胃黏膜組織Agilent-028004 SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray (Probe Name Version)芯片測序結(jié)果；GSE54129是基于GPL570平臺的111例胃癌組織與21例正常組織[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片測序結(jié)果。

1.3 基因功能及通路分析利用生物信息學功能注釋數(shù)據(jù)平臺DAVID (http://david.ncifcrf.gov/)，對與HOXC9基因共表達的基因進行基因本體分析(geneontology, GO)生物學過程富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，來找出最顯著的生物學注釋。

1.4 統(tǒng)計學處理Oncomine數(shù)據(jù)庫中分析HOXC9基因表達差異顯著性條件為P< 0.001；排序前10%的基因；表達差異級別>2倍。TCGA數(shù)據(jù)庫中HOXC9表達值采用兩獨立樣本校正t檢驗；GEO數(shù)據(jù)庫利用GEO2R在線分析功能，篩選標準為|log2 FC|>2并且調(diào)整后P< 0.05，其中FC為差異倍數(shù)，得到有差異的數(shù)據(jù)集后下載基因表達數(shù)據(jù)并在GraphPad 8.0中分析繪制統(tǒng)計圖。生存分析在Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫中采用log rank檢驗進行。

2 結(jié)果

2.1 HOXC9在多種腫瘤中高表達TIMER、Fire Browse數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)均顯示在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、食管癌、多形成性膠質(zhì)細胞瘤、頭頸鱗癌、胃癌等多種腫瘤組織中HOXC9表達值明顯高于正常組織。見圖1。

圖1 HOXC9在不同腫瘤中的表達情況分析(A：TIMER數(shù)據(jù)庫；B：Fire Browse數(shù)據(jù)庫)

2.2 HOXC9在胃癌中高表達情況Oncomine數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)顯示在胃癌中有2項研究提示HOXC9在胃癌中高表達。Cho的研究分析了19例正常人胃黏膜和20例胃癌組織中HOXC9的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腸型胃腺癌組織中HOXC9表達明顯高于正常胃黏膜，差異倍數(shù)為2.933，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.922，P<0.001)。DErrico的研究分析了31例正常人胃黏膜和4例混合型胃腺癌組織中HOXC9的表達，同樣發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中HOXC9表達明顯高于正常胃黏膜，差異倍數(shù)為3.839，差異有統(tǒng)計學意義(t= 6.704，P<0.001)。見圖2。

2.3 不同數(shù)據(jù)庫驗證HOXC9基因的表達以及HOXC9表達與胃癌患者預(yù)后的分析我們利用不同的數(shù)據(jù)庫分析HOXC9在胃癌組織中是否高表達，首先，GEPIA數(shù)據(jù)庫211例正常人組織和408例胃癌組織基因表達數(shù)據(jù)顯示，HOXC9表達明顯高于正常組織(P< 0.05)。TCGA數(shù)據(jù)庫中分析384例胃癌患者和37例健康人胃黏膜中HOXC9的表達數(shù)據(jù)，也發(fā)現(xiàn)HOXC9在胃癌中高表達(P< 0.001)。GSE65801與GSE54129的基因表達數(shù)據(jù)同樣提示HOXC9在胃癌患者中高表達(t= 9.368、6.789，P均<0.001)。Ualcan數(shù)據(jù)庫中分析了20例幽門螺桿菌感染的胃癌患者樣本和34例未感染幽門螺桿菌健康人胃組織標本中HOXC9的表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)HOXC9表達在幽門螺桿菌感染組表達更高(P< 0.001)。為了研究HOXC9在胃癌中的這種差異表達是否影響胃癌患者預(yù)后，我們用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫進行分析，并發(fā)現(xiàn)有1個相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)(ID: 231936-at)。我們利用該芯片數(shù)據(jù)生成了HOXC9高低表達組的生存曲線，發(fā)現(xiàn)HOXC9高表達組患者遠期生存率下降(P< 0.001)。以上結(jié)果提示HOXC9在胃癌中高表達，并與幽門螺桿菌感染相關(guān)，高表達HOXC9與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)。見圖3。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫示HOXC9在胃癌中的表達

2.4 HOXC9在胃癌中與其他共表達基因的聚類與相關(guān)性分析為了研究胃癌中HOXC9高表達與哪些基因相關(guān)，通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫獲取了與HOXC9表達正相關(guān)的基因，并利用R軟件包對相關(guān)系數(shù)高的基因進行聚類圖以及相關(guān)性圖分析，發(fā)現(xiàn)HOXC9與HOXC6、HOXC8、HOXC10、HOXC11、HOXC13、HOTAIR等20個基因有較高的共表達，相關(guān)系數(shù)分別為0.72、0.71、0.61、0.52、0.49、0.48。提示HOXC9可能與這些基因有功能上的相似性。見圖4。

2.5 HOXC9功能富集分析為了探究HOXC9在胃癌中發(fā)揮何種功能，我們對胃癌中與HOXC9表達正相關(guān)基因進行功能富集分析，GO分析發(fā)現(xiàn)HOXC9主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性，與特定DNA序列結(jié)合、染色體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞核、混合譜系白血病蛋白1(mixed lineage leukemia 1, MLL1)復(fù)合體等相關(guān)的基因功能上；KEGG通路富集分析提示HOXC9主要富集于鈣離子信使通路、環(huán)磷酸鳥苷酸依賴性蛋白激酶(cyclic guanosine monophosphate dependent protein kinase，cGMP-PKG)信號通路、腫瘤的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等通路。見圖5。

圖3 HOXC9在胃癌中的表達以及預(yù)后分析

圖4 胃癌中與HOXC9共表達基因分析(A：聚類分析；B：相關(guān)性分析)

圖5 胃癌中HOXC9共表達基因GO、KEGG富集分析(A：GO分析；B：KEGG分析)

3 討論

HOX是一類廣泛存在于各種真核生物體的，進化上高度保守的基因。根據(jù)其在染色體上的位置可將其分為HOXA、HOXB、HOXC、HOXD等4個基因群集。其中HOXC基因是HOX家族中一個具有高度保守性的亞類，其在細胞的分化、增殖、凋亡、血管生成等調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[8]。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)HOXC家族基因在大多數(shù)實體腫瘤類型中表達上調(diào)，包括結(jié)腸癌、肺癌、膠質(zhì)瘤和前列腺癌等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有密切的關(guān)系[9]。轉(zhuǎn)錄因子HOXC9作為HOXC家族成員之一，也是研究的熱點。Xuan等[10]的研究結(jié)果顯示HOXC9高表達的膠質(zhì)瘤患者具有不良的預(yù)后，另外，HOXC9蛋白表達降低后，可以顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。Hu等[11]使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了HOXC9在結(jié)直腸癌中的表達情況，同樣發(fā)現(xiàn)，HOXC9在腫瘤組織中的表達高于正常組織；HOXC9水平升高與遠端轉(zhuǎn)移和靜脈侵犯傾向相關(guān)，并且顯著降低了患者的總體生存率和無進展生存率。本研究通過TIMER、Fire Browse數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)HOXC9在多種腫瘤中高表達，而目前HOXC9在胃癌中的研究比較少，因此我們重點關(guān)注HOXC9在胃癌的表達，我們利用Oncomine、GEPIA、TCGA和GEO等多個數(shù)據(jù)庫中的基因表達數(shù)據(jù)，以及K-M Plotter數(shù)據(jù)庫中的預(yù)后信息，來探討HOXC9在胃癌中的表達情況及其表達對胃癌患者預(yù)后的影響。我們發(fā)現(xiàn)在Oncomine數(shù)據(jù)庫的兩項研究[12-13]、GEPIA數(shù)據(jù)庫、TCGA數(shù)據(jù)庫以及GEO數(shù)據(jù)庫的兩項研究[14-15]均發(fā)現(xiàn)HOXC9在胃癌組織中的表達明顯高于正常組織。同時，在Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫中有1項基因芯片結(jié)果表明HOXC9高表達的胃癌患者生存率明顯下降，以上結(jié)果提示HOXC9在胃癌中高表達并與患者不良預(yù)后有關(guān)。接下來，我們分析了胃癌組織中與HOXC9共表達的基因，發(fā)現(xiàn)HOXC9與HOXC6、HOXC8、HOXC10、HOXC11、HOXC13、HOTAIR等20個基因有較高的共表達，提示這些基因在功能上可能具有相似性，進一步對共表達基因進行GO、KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)HOXC9主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性，與特定DNA序列結(jié)合、染色體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞核、MLL1復(fù)合體等相關(guān)的基因功能上，以及鈣離子信使通路、cGMP-PKG信號通路、腫瘤的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等信號通路。

MLL1是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，在表觀遺傳學層面上控制著某些基因特別是HOX家族基因的表達[16]。 最新的一項研究發(fā)現(xiàn)MLL1促進人結(jié)腸腫瘤的自我更新，與結(jié)腸癌的不良預(yù)后相關(guān)[17]。而MLL1在胃癌中被發(fā)現(xiàn)可以募集到ANO1啟動子區(qū)域，促進組蛋白第三亞基四號賴氨酸三甲基化，并隨后促進ANO1表達，從而與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[18]。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)HOXC9與MLL1復(fù)合體相關(guān)，提示HOXC9的高表達可能與MLL1復(fù)合體的調(diào)控有關(guān)，從而促進了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

惡性腫瘤的發(fā)生起源于遺傳信息的畸變，其具體分子機制可以分為基因組的變異以及轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控的失調(diào)。轉(zhuǎn)錄的持續(xù)高水平活化是維持腫瘤惡性生物學行為的一個重要因素，因此利用轉(zhuǎn)錄失調(diào)過程中關(guān)鍵的調(diào)控因子開發(fā)有針對的靶向藥物也是腫瘤治療的一個新的策略[19]。我們的研究結(jié)果顯示HOXC9富集在腫瘤的轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路，提示HOXC9基因可能是胃癌核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路中的關(guān)鍵基因，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

總體上來說，我們的研究使用多種數(shù)據(jù)庫的不同來源的組織樣本，發(fā)現(xiàn)了HOXC9在胃癌中高表達，并且HOXC9高表達的胃癌患者生存率明顯下降，由此推測，HOXC9在胃癌中可能是一種原癌基因；由于胃癌的主要致病因素之一是幽門螺桿菌感染，而且幽門螺桿菌感染主要參與胃癌發(fā)生的早期階段[20]。我們分析了幽門螺桿菌感染的數(shù)據(jù)集，并且發(fā)現(xiàn)HOXC9在幽門螺桿菌感染的胃癌中表達上調(diào)。通過通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)了HOXC9引起胃癌的機制。根據(jù)以上結(jié)果，HOXC9可能會成為胃癌診治的一個新靶點。另外，通過這些數(shù)據(jù)庫挖掘分析數(shù)據(jù)可為臨床上胃癌的診斷以及預(yù)后評估提供參考，將為后續(xù)胃癌研究提供重要的理論依據(jù)。

本研究有一定的不足之處。雖然探究了HOXC9作為一種胃癌發(fā)病驅(qū)動基因的可能性，但研究僅限于公共數(shù)據(jù)分析，并無相關(guān)實驗數(shù)據(jù)支撐；雖然我們發(fā)現(xiàn)了幽門螺桿菌感染會引起HOXC9在胃癌細胞系中的表達上調(diào)，但尚不清楚幽門螺桿菌感染是通過何種機制引起該現(xiàn)象。因此，進一步實驗設(shè)計將搜集臨床樣本進行回顧性實驗，結(jié)合臨床信息來評估HOXC9表達與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，通過對HOXC9基因的敲低來探究其對胃癌細胞系功能的影響，并且研究幽門螺桿菌感染通過何種機制引起HOXC9表達的上調(diào)。以全面評估HOXC9作為一種新的胃癌診斷治療標記物的可能性。