王云飛 孫洋洋 帕依曼?亥米提 潘曉晗 徐向偉 何承輝

【摘 要】 目的：觀察景紅顆粒對(duì)急性血瘀大鼠凝血功能和血液流變學(xué)的影響，闡明其活血化瘀的作用機(jī)理。方法：采用注射腎上腺素并在冷水中游泳的方法形成血瘀模型，采血制備富血小板血漿和貧血小板血漿，采用三種不同的血小板聚集劑二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸（AA）和膠原（CG），測(cè)定血小板聚集率。取血測(cè)定全血粘度、血漿粘度及紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)。正常大鼠用電刺激的方法形成頸動(dòng)脈血栓，觀察景紅對(duì)血栓形成時(shí)間、血栓纖維蛋白量的影響。結(jié)果：景紅顆粒1.8 g/kg對(duì)AA引起的血小板聚集有明顯的抑制作用，3.6 g/kg對(duì)三種不同的聚集劑引起的血小板聚集均有明顯的抑制作用。景紅3.6g/kg能明顯抑制腎上腺素導(dǎo)致的低切變率下全血粘度的升高，對(duì)血漿粘度、紅細(xì)胞壓積無明顯影響。景紅顆粒能劑量依賴性延長(zhǎng)動(dòng)脈血栓形成時(shí)間，使血栓纖維蛋白量減少。結(jié)論：景紅顆粒能夠抑制血瘀大鼠血小板聚集，降低血粘度，延長(zhǎng)血栓形成時(shí)間，降低血栓纖維蛋白量，產(chǎn)生有益的活血化瘀作用，適用于氣虛血瘀型冠心病。

【關(guān)鍵詞】 景紅顆粒;血液流變學(xué);血栓形成;血瘀證

【中圖分類號(hào)】R285.6?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）05-0021-05

Study on the Effect of Jinghong Granule on Promoting Blood Circulation and Removing Blood Stasis

WANG Yunfei1 SUN Yangyang2 PA YimanHaimiti1 PAN Xiaohan2 XU Xiangwei2 HE Chenghui1*

1. Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi 830004，China;

2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300301，China

Abstract：Objective To investigate the effect of Jinghong granule on promoting blood circulation and removing blood stasis in acute blood stasis rats.Methods The subcutaneous injection of adrenaline and ice water bath were used to establish the acute blood stasis rats model.Blood was collected from abdominal aorta to prepare platelet-rich plasma and platelet-poor plasma. Three platelet aggregating agents， adenosine diphosphate （ADP）、Arachidonic acid （AA）， collagen （CG）， were employeed to test the Platelet aggregation rate. Whole blood viscosity（WBV），plasma viscosity（PV），erythrocyte hematocrit （HCT） were observed to study the effects of Jinghong granule on hemorheology in rats with acute blood stasis.The carotid artery thrombosis in rats was formed by electrical stimulation， and the effects of Jinghong granule on thrombosis time and thrombus fibrin content were observed. Result Jinghong granule 1.8 g/kg has obvious inhibitory effect on platelet aggregation caused by AA， and 3.6 g/kg has obvious inhibitory effect on platelet aggregation caused by three different aggregating agents. Jinghong 3.6 g/kg can obviously inhibit the increase of whole blood viscosity and plasma viscosity under low shear rate caused by epinephrine in rats. There was no obvious effect on plasma viscosity and hematocrit. Jinghong granule group with low， medium and high dose can prolong the time of arterial thrombosis in a dose-dependent manner; The amount of thrombotic fibrin was reduced respectively. Conclusion Jinghong granule have the effect of improving blood hemorheology and inhibiting platelet aggregation rate.

Keywords：Jinghong Granule;Hemorheology;Thrombosis;Syndrome of Blood Stasis

中醫(yī)認(rèn)為氣血是構(gòu)成和維持人體生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，“氣為血帥，血為氣母”，兩者在物質(zhì)和功能上互生互助[1]。血瘀證是中醫(yī)臨床常見病理癥候[2]，與多種疾病相關(guān)，如冠心病、心絞痛，動(dòng)脈粥樣硬化等[3-5]，其中醫(yī)治療原則為活血化瘀[6]。近年來中醫(yī)藥在早期預(yù)治心腦血管疾病[7-8]，發(fā)現(xiàn)有效的作用靶點(diǎn)[9-10]，開辟新的治療方法等方面有很好的療效和廣闊的應(yīng)用前景[11-12]，成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

景紅顆粒是由紅景天、赤芍、黃芪等藥材組成的復(fù)方制劑，藥材紅景天中的苷類成分紅景天苷和赤芍中的單萜及其苷類成分芍藥苷，黃芪中的皂苷類有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷，這些有效成分都具有益氣行血、活血化瘀、通絡(luò)開竅等功效[13]。

景紅顆粒臨床應(yīng)用多年，療效確切，具有活血通脈、養(yǎng)心益氣、化瘀止痛的功效，用于氣虛血瘀所致的冠心病、心絞痛等心血管疾病[13]。本研究采用急性大鼠血瘀模型，評(píng)價(jià)景紅顆粒對(duì)大鼠血小板聚集功能和血液流變學(xué)的影響，闡述傳統(tǒng)中醫(yī)病機(jī)和現(xiàn)代疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及兩者的聯(lián)系，明確藥理作用機(jī)制，為景紅顆粒臨床用藥的有效性及新藥研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 景紅顆粒由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所提供，新疆銀朵蘭維藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)180920。為黃棕色至棕色顆粒劑，鋁塑袋包裝，每袋6 g。臨用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成所需濃度藥液，供動(dòng)物給藥用。參芍膠囊保定天浩制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)181003。每粒膠囊250mg。臨用時(shí)，倒出膠囊內(nèi)容物，以0.5%CMC-Na配制成所需濃度藥液，供動(dòng)物給藥用。腺苷二磷酸鈉（Adenosine Diphosphate，ADP）：SIGMA公司產(chǎn)品，批號(hào)01905?；ㄉ南┧徕c（Arachidonic，AA）：SIGMA公司產(chǎn)品，批號(hào)SLBT0162。膠原（Collagen，CG）：CHRONO-LOG公司產(chǎn)品，批號(hào)3479。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，索萊寶科技有限公司（Solarbio）產(chǎn)品，批號(hào)20190904。GF254薄層色譜硅膠：青島海洋化工廠;有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2 動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。

Wistar大鼠，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。

1.3 儀器與設(shè)備 540型血小板聚集儀，美國(guó)CHRONO-LOG公司產(chǎn)品。LBY-6COMPACT全自動(dòng)血液流變儀，北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血瘀模型大鼠的制作 大鼠雌雄各半，參照文獻(xiàn)方法[10]除正常對(duì)照組外，于實(shí)驗(yàn)前一天皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.8 mL/kg，共2次，間隔6h，期間（約3 h）將大鼠放入冰水中游泳5min，禁食不禁水過夜，造成血瘀模型。

1.4.2 血瘀大鼠血小板聚集檢測(cè) 雄性SD大鼠，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7d，給藥體積均為10 mL/kg。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予0.5%CMC-Na、受試物藥組給予景紅顆粒 ，劑量分別為0.9、1.8、3.6g/kg;陽性藥組給予參芍顆粒200 mg/kg。給藥第6天造模，次日給藥后60 min水合氯醛麻醉（360 mg/kg，ip），腹主動(dòng)脈取血，3.2%枸櫞酸鈉抗凝，全血與抗凝劑體積之比9∶1，800 rpm離心10 min制備富血小板血漿（PRP），3000 rpm離心10 min制備貧血小板血漿（PPP）。以PPP調(diào)PRP，使其血小板計(jì)數(shù)保持在（3.5～4.0）×108個(gè)/mL。比濁法測(cè)定血小板聚集率。以PPP調(diào)100%，PRP調(diào)零，在連續(xù)攪拌下加入誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸鈉（AA）、膠原（CG），引起血小板聚集。觀察不同藥物對(duì)血小板聚集功能的影響，并與溶劑對(duì)照組比較，計(jì)算血小板聚集抑制率。

1.4.3 血液流變學(xué)參數(shù)測(cè)定 雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，給藥體積均為10 mL/kg。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均給予0.5%CMC-Na，受試藥組給予景紅，劑量分別為0.9、1.8、3.6 g/kg，相當(dāng)于人臨床擬用量的0.5、1、2倍;陽性藥組給予參芍，劑量為200 mg/kg，相當(dāng)于臨床用量。給藥第6天造模，次日給藥后60 min水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血7 mL，5 mL置肝素化試管抗凝，進(jìn)行全血粘度測(cè)定，3000 rpm、25 ℃離心10 min后取血漿測(cè)定血漿粘度，2 mL置紅細(xì)胞壓積管枸櫞酸鈉抗凝，并同時(shí)以紅細(xì)胞壓積管測(cè)定紅細(xì)胞壓積。

1.4.4 對(duì)血栓纖維蛋白量的影響 雄性SD大鼠，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只。給藥方法同上。末次給藥后1 h，35%水合氯醛麻醉（350 mg/kg，ip），大鼠仰臥位固定，分離頸總動(dòng)脈，置于BT87-3型實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)血栓形成測(cè)定儀的刺激電極和溫度探頭鉤上，溫度探頭在遠(yuǎn)心端，刺激電極靠近心端。記錄從刺激開始到動(dòng)脈溫度驟降所需的時(shí)間（s），作為動(dòng)脈血栓形成時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取出頸動(dòng)脈內(nèi)的血栓，將其置于1 mL0.5NNaOH溶液中，待血栓溶解后測(cè)定血栓纖維蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x? ±s）表示，以ANOVA單因素方差分析比較不同組間均數(shù)差異顯著性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 景紅顆粒對(duì)血小板聚集功能的影響 造成“血瘀”模型后，ADP、AA、CG均可誘導(dǎo)模型大鼠PRP產(chǎn)生明顯的血小板聚集現(xiàn)象，連續(xù)7d給予景紅0.9、1.8、3.6 g/kg能對(duì)血小板聚集產(chǎn)生明顯的抑制作用，1.8 g/kg景紅與參芍比較，無明顯差異。結(jié)果見表1。

2.2 景紅顆粒對(duì)血瘀大鼠血液流變學(xué)參數(shù)的影響

2.2.1 對(duì)全血粘度的影響 造成“血瘀”模型后，可見動(dòng)物全血粘度增加，與模型對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01～0.001）。高劑量景紅可明顯降低低切變率下全血粘度，對(duì)高切變率下全血粘度未見明顯影響。說明藥物可抑制"血瘀"模型所造成的全血粘度增加。陽性藥物參芍不影響各切變率下全血粘度。結(jié)果見表2。

2.2.2 對(duì)血漿粘度和血細(xì)胞壓積的影響 造成“血瘀”模型后，可見動(dòng)物血漿粘度增加，與溶劑對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。給予景紅0.9、1.8、3.6 g/kg后血漿粘度與模型對(duì)照組無明顯差異。對(duì)紅細(xì)胞壓積亦無明顯影響。陽性藥物參芍對(duì)血漿粘度和紅細(xì)胞壓積無明顯影響。結(jié)果見表3。

2.3 對(duì)大鼠血栓形成的影響

2.3.1 對(duì)動(dòng)脈血栓形成時(shí)間的影響 結(jié)果表明，大鼠灌服景紅能劑量依賴性延長(zhǎng)電刺激引起的動(dòng)脈血栓形成時(shí)間，與溶劑對(duì)照組比較0.9、1.8、3.6 g/kg分別延長(zhǎng)了9.8%（P>0.05）、23.4%（P<0.05）、36.6%（P<0.01）。參芍明顯延長(zhǎng)血栓形成時(shí)間，延長(zhǎng)了17.7%（P<0.05）。1.8 g/kg景紅與參芍比較，無明顯差異。結(jié)果見表4、圖1。

2.3.2 對(duì)血栓纖維蛋白量的影響 結(jié)果表明，大鼠灌服景紅0.9、1.8、3.6 g/kg能劑量依賴性減少電刺激引起的動(dòng)脈血栓纖維蛋白量，與溶劑對(duì)照組比較分別減少了20.6%（P>0.05）、32.4%（P>0.05）、52.6%（P<0.01）。參芍不影響血栓纖維蛋白。1.8 g/kg景紅與參芍比較，無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果見表5、圖1。

3 討論

正常的血液流變性能保持組織灌注和代謝功能。凝血和纖溶系統(tǒng)是調(diào)節(jié)人體血液凝固和纖維蛋白溶解的調(diào)控系統(tǒng)[14]，是維持血液的正常功能、血管通暢的關(guān)鍵調(diào)控因素，血小板在血栓形成過程中發(fā)揮重要作用[15]。血液功能的異常表現(xiàn)為凝血及纖溶活性異常，血液流變性異常，血流動(dòng)力學(xué)異常等[16-17]。全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)的改變是氣滯血瘀癥的物質(zhì)基礎(chǔ)[18]。

中醫(yī)藥在治療氣虛血瘀型冠心病心絞痛中能發(fā)揮獨(dú)特且重要的作用[19-21]，治療上多以活血化瘀為主要手法，輔以益氣、溫陽、化濁等治療原則[22-24]。冠心病心絞痛在中醫(yī)理論中屬“胸痹”的范疇，胸痹的病機(jī)大致分四種，腎氣虛衰心脈痹阻、飲食不節(jié)痰郁化火、情志失調(diào)肝郁氣滯以及素體陽虛外感寒邪而導(dǎo)致心血瘀阻而發(fā)病，也就是心脈發(fā)生了血瘀證。血瘀證往往伴隨血液和血管異常而導(dǎo)致血液循環(huán)障礙[25]。本研究采用的動(dòng)物模型是一種經(jīng)典的血瘀模型，屬于中藥藥理研究常用經(jīng)典方法，即給小鼠注射腎上腺素，造成其活動(dòng)增加，類似于中醫(yī)所講陽氣過度消耗而致陽虛，再進(jìn)行低溫游泳模擬外感陰寒之邪并在強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)中進(jìn)一步消耗其陽氣，造成氣（陽）虛血瘀模型[26]。病機(jī)類似于氣虛血瘀型，素體陽虛胸陽不振者遇陰寒之邪趁虛而入，則寒凝氣滯，血行不暢而致心血瘀阻。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型大鼠較正常動(dòng)物血粘度增高，較正常血小板對(duì)誘導(dǎo)劑（ADP、AA）敏感度上升，血液呈高凝、高黏的狀態(tài)，說明造成了“血瘀”的模型。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖翘接懢凹t顆粒治療冠心病心絞痛的機(jī)制，并針對(duì)其活血通脈、養(yǎng)心益氣的治則選用了氣虛血瘀的模型。景紅顆粒也遵循這些治則進(jìn)行了組方，結(jié)果表明該藥可改善模型大鼠血液流變學(xué)，抑制血小板聚集，還可明顯延長(zhǎng)正常動(dòng)物血栓形成時(shí)間，減少血栓纖維蛋白量，說明景紅顆粒有明顯的抗血栓作用，也體現(xiàn)了中醫(yī)所講的活血化瘀作用。綜上所述，景紅顆粒的藥理作用及其機(jī)制是：通過抗血小板聚集、抗栓作用和改善血液流變學(xué)的作用，發(fā)揮其活血化瘀的功效，可用于防治冠心病心絞痛，還可能通過該作用防治其他血栓性疾病。研究結(jié)論為景紅顆粒在新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用階段提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]何浩強(qiáng)， 陳光，高嘉良，等.氣滯血瘀證生物學(xué)基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志， 2019，34（9）：4167-4171.

[2]王凱，孫丹春，楊濤濤，等. 十五味冠心寧湯治療冠心病心絞痛氣虛血瘀證的臨床觀察[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2020，27（2）：229-230.

[3]楊延澤，鄧毅，楊秀娟，等. 當(dāng)歸不同配伍對(duì)急性血瘀大鼠血液流變學(xué)、凝血功能及心、肺病理影響[J].中藥藥理與臨床， 2018，34（6）：125-129.

[4]MA C Y， LIU J H， LIU J X，et al. Relationship between two blood stasissyndromes and inflammatory factors in patients with acute coronary syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine，2017，23（11）：1-5.

[5]陳奇. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1168-1170.

[6]陳維武，劉靜，陸潔，等.白脈軟膏對(duì)腦卒中的治療作用研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2017，40（2）：196-200.

[7]LI H Q，WEI J J，XIA W， et al. Promoting blood circulation for removing blood stasis therapy for acute intracerebral hemorrhage： a systematic review and meta-analysis[J].Acta Pharmacol Sin， 2015，36（6）：659-675.

[8]LI J Y，YUAN L X，ZHANG G M，et al. Activating blood circulation to remove stasis treatment of hypertensive intracerebral hemorrhage： A multi-center prospective randomized open-label blinded-endpoint trial[J]. Chin J Integr Med， 2016，22（5）：328-334.

[9]WANG C，YANG Y G，WANG X L. Expressions of hTERT， p53， c-erbB-2 and Bcl-2 in Colonic Adenocarcinoma Mouse Models With Liver Metastases： Effects of Classical Traditional Chinese Medicine Prescriptions for Promoting Circulation and Removing Blood Stasis[J].Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao， 2004，24（7）：758-760.

[10]XIONG X J，WANG Z，WANG J. Innovative Strategy in Treating Angina Pectoris with Chinese Patent Medicines by Promoting Blood Circulation and Removing Blood Stasis： Experience from Combination Therapy in Chinese Medicine[J]. Curr Vasc Pharmacol， 2015，13（4）：540-553.

[11]YUAN T H，CHEN Y，ZHOU X Q， et al. Effectiveness and safety of Danshen injection on heart failure： Protocol for a systematic review and meta-analysis[J]. Medicine （Baltimore）， 2019，98（22）：e15636.

[12]LIU Y，YIN H J，SHI D Z， et al. Chinese herb and formulas for promoting blood circulation and removing blood stasis and antiplatelet therapies[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2012（2012）：184503.

[13]劉桂花，王云飛，于寧，等. 基于多指標(biāo)權(quán)重分析和正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選景紅顆粒復(fù)方提取工藝[J].中國(guó)新藥雜志.2019，28（10）：1178-1183.

[14]LIANG H， CHEN S， SHEN S. Clinical observation on influence of chinese medicines for promoting blood circulation to remove blood stasis on FIB and DD in plasma of patients with cerebral thrombosis[J]. J Tradit Chin Med， 2002，22（4）：256-259.

[15]王階，李軍，毛靜遠(yuǎn)，等.冠心病心絞痛主要證型的辨證診斷標(biāo)準(zhǔn) [ J ]，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2018，38（2）：154-155.

[16]段練， 劉詠梅， 王階. 血瘀證中醫(yī)證候模型的現(xiàn)狀與展望[J]. 中醫(yī)雜志， 2017， 58（4）： 346 -350.

[17]付長(zhǎng)庚.冠心病血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[18]高沖，劉璐，胡愛菊，等.活血化瘀中藥的藥理作用研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2013，36（1）：64-68.

[19]寇韓旭，董坤，寧馨，等. 蓬子菜總黃酮對(duì)急性血瘀大鼠血液流變學(xué)影響及作用機(jī)制的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)， 2015，43（1）：11-15.

[20]譚鋼，楊玉剛， 白穎舜. 體外反搏聯(lián)合中醫(yī)藥治療氣虛血瘀型冠心病心絞痛綜述[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18（10）：14-16.

[21]周文功，史加鑫.中醫(yī)藥治療氣虛血瘀型冠心病研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（4）72-73.

[22]李夢(mèng)茜，陳啟蘭.中醫(yī)藥治療氣虛血瘀型冠心病心絞痛臨床研究進(jìn)展[J].新中醫(yī)，2019，51（12）：21-25.

[23]陳奇. 中藥藥理研究方法學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1993.

[24]武曉偉， 劉聰， 李佳，等. 芪蛭通絡(luò)膠囊及其9味活血化瘀藥拆方對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥房，2019，30（19）：2674-2678.

[25]蘇益仁.血府逐瘀湯加減治療冠心病心絞痛131例療效觀察[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2018，27（4）：82-83.

[26]李祥，張悅，張文智，等.氣虛血瘀證動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2020，26（2）：228-234.

（收稿日期：2020-09-10 編輯：劉斌）

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（KY2018134，KY2018136）。

作者簡(jiǎn)介：王云飛（1985-），女，漢族，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯芯?。E-mail：741046021@qq.com

通信作者：何承輝（1976-），女，漢族，碩士，研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯芯颗c開發(fā)。E-mail：1369467054@qq.com