寧學(xué)斌 劉曉光 張岸平 高利常 李 冀

華北理工大學(xué)理學(xué)院 河北唐山 063210; ①生命科學(xué)學(xué)院

原發(fā)性高血壓(EH )是一種常見(jiàn)的危害人類健康的心腦血管疾病，是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)、腦梗死和腎功能衰竭的主要危險(xiǎn)因素之一[1]。EH及其誘發(fā)的腦梗死作為心血管疾病主要危險(xiǎn)因素存在一定的發(fā)病聚集性，二者并存可使心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增加，但目前對(duì)二者的并發(fā)機(jī)制尚不清楚,亟待探討EH誘發(fā)腦梗死的分子遺傳機(jī)制，以有效降低心血管疾病發(fā)病率。目前研究普遍認(rèn)為EH、CHD 等心血管疾病為多因素疾病，因多個(gè)易感基因的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)微效作用的累加及環(huán)境因素共同作用而發(fā)病。Jeunemaitre[2]等研究提出，血管緊張素原 (AGT)基因M235T位點(diǎn)多態(tài)性與EH之間有顯著關(guān)聯(lián)。本次研究以SNPstream技術(shù)[3]和RFLP-PCR技術(shù)篩查AGT及相關(guān)基因變異，并分析可能的基因-基因、基因-環(huán)境之間的交互作用，為深入探討和闡明ET誘發(fā)腦梗死的分子遺傳機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年3～10月收集唐山市3所“三甲”醫(yī)院的初發(fā)腦血栓患者498例為觀察組，入選標(biāo)準(zhǔn)：符合WHO/ISH(國(guó)際高血壓聯(lián)盟)的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)；未服用降壓藥物者收縮壓/舒張壓≥140/90mmHg，服用降壓藥物者收縮壓/舒張壓<140/90mmHg。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有器質(zhì)性疾病、精神性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤的患者。根據(jù)匹配因素(民族、性別、年齡)選擇同期健康體檢者506人為對(duì)照組，入選對(duì)象對(duì)研究均知情同意。

1.2研究方法

1.2.1數(shù)據(jù)調(diào)查及臨床檢測(cè) 調(diào)查內(nèi)容包括姓名、性別、年齡、身高、體質(zhì)量、吸煙史、飲酒史等。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)等。

1.2.2建立DNA標(biāo)本庫(kù) 由專人采集被檢者晨起空腹靜脈血3mL，加入EDTA抗凝管，用酚-氯仿法提取血液基因組DNA，實(shí)施濃度測(cè)定及標(biāo)化，檢測(cè)DNA濃度后，用高純水稀釋至20ng/μL，在-20℃樣品庫(kù)中保存。

1.2.3nmSNP位點(diǎn)的篩選 在人類單倍體圖計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)上，對(duì)中國(guó)漢族人的遺傳信息進(jìn)行檢索，獲取AGT基因上的12個(gè)tagSNP信息，其中AGT基因標(biāo)簽SNP共8個(gè)高突變位點(diǎn)。再利用NCBI網(wǎng)站檢索確定處于同一連鎖群的AGT基因的SNPs突變位點(diǎn)，選取標(biāo)準(zhǔn)為(SNP,AGT,1,M issensehom o sapiens)總計(jì)51個(gè)位點(diǎn)，剔除第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ外顯子及合并相同報(bào)道后，有21個(gè)位點(diǎn)是發(fā)生在AGT基因第Ⅱ外顯子上的錯(cuò)義突變SNP位點(diǎn)，它們分別是rs61762541等。從21個(gè)位點(diǎn)中選取文獻(xiàn)報(bào)道中高頻錯(cuò)義突變位點(diǎn)，包括rs699(M235T)、rs7079、rs1078499、rs11122577、rs11122575、rs2478523、rs2493132、rs2478543、rs3789678、rs3789671、rs3889728、rs7539020。將AGT基因長(zhǎng)度前后擴(kuò)大5kb，增加4個(gè)位點(diǎn)，分別為 rs11568046、rs2493137、rs4628514、rs7536290?？傆?jì)16個(gè)SNP位點(diǎn)作為研究的目標(biāo)。

1.2.4SNPs分型 將-20℃保存的DNA稀釋到10ng/μL。將多重PCR(M ultiplex PCR)技術(shù)與單堿基延伸分型技術(shù)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 ，擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行純化、雜交。采用Beckman公司SNP分型系統(tǒng)(SNP Stream)對(duì)獲得含有待檢測(cè)突變位點(diǎn)的基因片斷進(jìn)行12重或者48重的多重LDR(M ultiplex LDR)反應(yīng)，最后通過(guò)微陣列將其區(qū)分開(kāi)，并采用測(cè)序儀/基因分析儀毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析結(jié)果[4-6]。

1.2.5多重引物、tag SNP的PCR引物及單堿基延伸引物設(shè)計(jì) 首先要選定tagSNP，將其rs編號(hào)輸入至AP Editor程序，在NCBI db SNP下載位點(diǎn)附近序列和mask序列，使其轉(zhuǎn)換為基因型(如G/T型轉(zhuǎn)換為C/A型)，然后通過(guò)引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站查找相關(guān)的引物信息。引物設(shè)計(jì)成功的SNP位點(diǎn)，將獲得三條引物，包括PCR引物2條和單堿基延伸引物1條。

1.2.6聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測(cè) 用于rs7536290位點(diǎn)，檢測(cè)基因多態(tài)性。查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得位點(diǎn)序列，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物。PCR反應(yīng)；PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳；限制性內(nèi)切酶Alu I內(nèi)切反應(yīng)。電泳檢測(cè)：Alu I 的識(shí)別序列為 AGCT。利用錯(cuò)配引物，將錯(cuò)配堿基引入，以獲得酶切識(shí)別序列。當(dāng)位點(diǎn)堿基是GG時(shí)，內(nèi)切酶會(huì)將PCR產(chǎn)物分成126bp和161bp片段；當(dāng)位點(diǎn)堿基是AA時(shí)，內(nèi)切酶無(wú)法識(shí)別位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度不變；當(dāng)基因型是雜合子時(shí)，酶切電泳可將287bp、161b、126bp 三個(gè)條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 13.0軟件行統(tǒng)計(jì)分析。①單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析：兩組之間單位點(diǎn)的基因頻率和等位基因頻率分布差異通過(guò)卡方檢驗(yàn)，調(diào)整混雜因素非條件Logistic回歸分析；②各位點(diǎn)之間的LD度量：各位點(diǎn)兩兩之間的D值和P值用Haploview軟件進(jìn)行計(jì)算；③單倍型關(guān)聯(lián)性分析：應(yīng)用Haploview軟件推定各樣本的單倍型，再用卡方檢驗(yàn)分析各單倍型頻率在兩組之間的差異；④計(jì)數(shù)資料采用方差分析，分類資料采用卡方檢驗(yàn)結(jié)合Logistic回歸模型評(píng)價(jià)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料比較 兩組年齡、性別、HDL-C比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組身高低于對(duì)照組，體質(zhì)量、BMI、TG、TC高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料和生化指標(biāo)比較

2.2兩組tag SNP的基因型頻數(shù)與HWE檢驗(yàn)比較 在16個(gè)tagSNP中，15個(gè)位點(diǎn)符合哈代-溫伯格平衡(P>0.05)，提示，SNPStream、PCR-RFLP技術(shù)方案可行、結(jié)果可信，入選對(duì)象具有代表性。位點(diǎn)缺失占比為2.71%(444/16384)，見(jiàn)表2。

2.3tag SNP的危險(xiǎn)性分析 rs699多態(tài)性、rs7079多態(tài)性、rs1078499多態(tài)性、rs2478523多態(tài)性、rs2478543多態(tài)性、rs2493137多態(tài)性、rs3789671多態(tài)性、rs3889728多態(tài)性、rs4628514多態(tài)性、rs7536290多態(tài)性、rs7539020多態(tài)性、rs11122575多態(tài)性、rs11122577多態(tài)性、rs11568046多態(tài)性與EH誘發(fā)腦梗死病無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。rs2493132多態(tài)性、rs3789678多態(tài)性分別與EH誘發(fā)腦梗死病相關(guān)(P<0.05)。攜帶 rs3789678C等位基因發(fā)生疾病風(fēng)險(xiǎn)比攜帶 T 等位基因增加1.28倍(95%CI： 1.08-1.52，P=0.004)。攜帶rs2493132C等位基因發(fā)生疾病風(fēng)險(xiǎn)比攜帶T等位基因增加1.19倍(95%CI：1.04-1.35，P=0.014)。見(jiàn)表3。

表2 兩組tag SNP的基因型頻數(shù)與HWE檢驗(yàn)比較

SNP位點(diǎn)nrs3789678rs3889728rs4628514rs7536290rs7539020rs11122575rs11122577rs11568046等位基因C/TA/GC/TA/GC/TC/TA/CC/T觀察組498AA3481211113104256116AB96254259163210232145115BB2511712521235198337366FL296341112511對(duì)照組506AA3471091033174757155AB131240276165209235145114BB2615112623249213340383FL26111164H-W檢驗(yàn)χ2值12.31.670.580.280.0050.150.252.56P值0.00030.180.460.610.980.710.660.13

表3 tag SNP的危險(xiǎn)性分析

SNP位點(diǎn)nrs3789678rs3889728rs4628514rs7536290rs7539020rs11122575rs11122577rs11568046等位基因C/TA/GC/TA/GC/TC/TA/CC/T觀察組498A792496481783294344167127B146488509205680628819847對(duì)照組506A825458482799303349175124B183542528211707661825880χ2值8.080.260.950.170.0450.160.380.42P值0.004*0.630.350.690.850.750.550.53OR1.281.031.061.0311.030.961.0695%CIlower1.080.920.940.90.870.910.830.82upper1.521.181.211.221.131.161.131.12

3 討論

SNPs是染色體DNA序列中的某個(gè)位點(diǎn)由于單個(gè)核苷酸的變化而引起的多態(tài)性。SNPs數(shù)量多、分布廣，每個(gè)個(gè)體至少攜帶300萬(wàn)個(gè)SNPs；SNPs的存在穩(wěn)定且容易篩查，每一代中每個(gè)核苷酸變異隨機(jī)，這種變異是二態(tài)性標(biāo)記，非此即彼，有利于實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化篩查和分析。不同SNPs的不同組合，使不同人群具有不同的心腦血管疾病易患性，導(dǎo)致相應(yīng)疾病的臨床表現(xiàn)各異，治療效果也不同。

目前，AGT基因多態(tài)性與高血壓的相關(guān)性研究比較多，但主要集中在其啟動(dòng)子區(qū)域和第二外顯子位置上。有研究對(duì)AGT 上5個(gè)位點(diǎn)( C-532T，A-217G，A-6G，C3889T，M235T)多態(tài)性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，亞裔美國(guó)人與歐洲籍美國(guó)人均為陰性[7]。而Watkins WS等[8]對(duì)高血壓患者256 例與正常人126 例開(kāi)展對(duì)照，通過(guò)AGT基因檢測(cè)，24個(gè)SNPs位點(diǎn)中有7個(gè)相同，部分結(jié)果也相近。還有學(xué)者認(rèn)為，AGT基因T/T基因型與腦梗死無(wú)關(guān)，與腦出血也無(wú)關(guān)，但會(huì)增加ACE基因DD基因型個(gè)體患腦梗死的危險(xiǎn)性。也有學(xué)者認(rèn)為AGT基因T/T型可能與多發(fā)性腦梗死的發(fā)病相關(guān)。晏玉奎等[9]認(rèn)為AGT T704Crs699位點(diǎn)多態(tài)性可能是小動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(SA)發(fā)病機(jī)制的遺傳因素,且攜帶AGTCC基因型、高血壓病史和老年患者具有協(xié)同致病效應(yīng)。和姬苓等研究認(rèn)為腎素REN基因 10631AA基因型和A等位基因以及AGT的T704C基因型和C等位基因可能為腦梗死的易感因素，單倍型T704C-10631A可能是腦梗死發(fā)病遺傳危險(xiǎn)因素；其研究也涉及AGT521T基因型和T等位基因以及單倍型521T-10631A-704C，認(rèn)為這些位點(diǎn)突變是腦梗死的易患因素[10-11]。崔金環(huán)等[12]通過(guò)研究我國(guó)南方人群認(rèn)為AGT、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和eNOS基因多態(tài)性可能是該地區(qū)人群腦梗死的遺傳危險(xiǎn)因素,但在腦梗死的發(fā)生中不具有交互作用，并不增加腦梗死發(fā)生機(jī)率。王埮等[13]研究認(rèn)為， AGT基因四個(gè)位點(diǎn)的SNPs及其構(gòu)成的單倍型與海南黎族EH并腦梗死的相關(guān)性，認(rèn)為C-18T多態(tài)的基因型和等位基因、A-6G 多態(tài)的G等位基因均為EH并腦梗死危險(xiǎn)因素，單倍型分析提示由-20C和-6G 構(gòu)成的H6單倍型在EH并腦梗死組中明顯增加。張劍平等[14]研究認(rèn)為M 235T基因多態(tài)性是EH合并腦梗死患者發(fā)病的遺傳危險(xiǎn)因素。且有高血壓家族史患者的CC純合子更易患腦梗死。本研究對(duì)AGT基因tagSNP位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)14個(gè)位點(diǎn)為陰性，包括M235T等2個(gè)位點(diǎn)陽(yáng)性。