李一仙，楊軍，夏宇

過(guò)敏是一個(gè)全球性問(wèn)題，隨著現(xiàn)代工業(yè)化的進(jìn)程，過(guò)敏性疾病的發(fā)生率顯著增高。過(guò)敏原是其發(fā)病的主要原因，而過(guò)敏原檢測(cè)是最重要的診斷依據(jù)。目前過(guò)敏原的檢測(cè)手段日益增多與完善，其對(duì)于不同年齡組、各類過(guò)敏性疾病等的適宜性不同，而臨床工作者對(duì)各種檢測(cè)方法的選擇往往存在困擾。另有原發(fā)性免疫缺陷病這類特殊患者，皮疹嚴(yán)重、IgE明顯升高，極易與過(guò)敏性疾病混淆。故總結(jié)歸納過(guò)敏原的各種檢測(cè)方法及其新進(jìn)展，對(duì)查找過(guò)敏原并予以針對(duì)性防控，從而減少過(guò)敏性疾病的發(fā)作具有重要的臨床意義。

過(guò)敏性疾病的發(fā)病機(jī)制包括：IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)、其他3型變態(tài)反應(yīng)和類過(guò)敏反應(yīng)。其中IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)是最主要的機(jī)制。傳統(tǒng)的過(guò)敏原檢測(cè)主要分為兩大類，即體內(nèi)檢測(cè)和體外檢測(cè)。體內(nèi)檢測(cè)主要有：皮膚試驗(yàn)(包括：皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)、皮內(nèi)試驗(yàn)、特應(yīng)性斑貼試驗(yàn))、口服食物激發(fā)試驗(yàn)；體外檢測(cè)主要有IgE依賴的熒光酶標(biāo)法、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法等及非IgE依賴的嗜酸細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白檢測(cè)。IgE依賴的過(guò)敏原檢測(cè)是目前應(yīng)用最廣泛的手段，其正往更快速、更微量血樣、更多檢測(cè)項(xiàng)目、更高靈敏度和精密度的方向發(fā)展，出現(xiàn)了生物芯片、分子診斷等手段；而非IgE依賴的過(guò)敏原檢測(cè)方法也因商業(yè)性的嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)誕生，彌補(bǔ)了IgE依賴的過(guò)敏原檢測(cè)方法的不足，但技術(shù)尚未成熟。

1 體內(nèi)檢測(cè)方法

1.1 皮膚試驗(yàn) 皮膚試驗(yàn)是診斷IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的一線方法。其臨床價(jià)值在于通過(guò)皮膚對(duì)變應(yīng)原的反應(yīng)代替全身性過(guò)敏反應(yīng)(鼻、肺、眼、腸道)，因?yàn)槠浜?jiǎn)單、直觀、成本低且安全性高，是目前應(yīng)用最廣泛的方法[1]。

1.1.1 皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(skin prick test，SPT) SPT是通過(guò)特制的點(diǎn)刺針將皮膚淺層刺破，使特定的變應(yīng)原滲入皮膚組織，IgE結(jié)合變應(yīng)原后與真皮的肥大細(xì)胞膜FсεR1受體交聯(lián)，致敏肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺和其他炎性介質(zhì)，引起皮膚局部毛細(xì)血管擴(kuò)張和通透性增加，表現(xiàn)出風(fēng)團(tuán)和紅斑樣改變[1]。若與陰性對(duì)照(生理鹽水)比較，風(fēng)團(tuán)直徑>3 mm為陽(yáng)性，若風(fēng)團(tuán)直徑<3 mm，同時(shí)組胺(陽(yáng)性對(duì)照液)呈陽(yáng)性，則認(rèn)為結(jié)果為陰性[2]。

SPT被認(rèn)為是可靠的過(guò)敏原檢測(cè)方法，其與血清特異性IgE的符合率達(dá)80%～90%。患者SPT陽(yáng)性或者過(guò)敏原特異性IgE(specific IgE，sIgE)升高均證明對(duì)該過(guò)敏原敏感(即“敏化”)，但敏感患者需暴露后產(chǎn)生臨床癥狀才稱之“過(guò)敏”。湯建萍[3]研究表明，SPT陽(yáng)性預(yù)報(bào)正確率<50%，而陰性預(yù)報(bào)正確率>95%，說(shuō)明SPT陰性可基本排除該過(guò)敏原IgE介導(dǎo)的過(guò)敏，而SPT陽(yáng)性還需激發(fā)試驗(yàn)進(jìn)一步確診。歐洲人群中，SPT對(duì)哮喘、過(guò)敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和食物過(guò)敏的臨床陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)80%，而且風(fēng)團(tuán)越大，過(guò)敏的可能性越高[1]，但其大小與過(guò)敏的嚴(yán)重程度無(wú)相關(guān)性，SPT不能用于疾病的危險(xiǎn)程度評(píng)估。SPT適用于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的疾病包括：過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、食物過(guò)敏、青霉素/毒液/乳膠過(guò)敏，且任何年齡的患者均可，但不同年齡的反應(yīng)性有差異，如嬰兒的陽(yáng)性反應(yīng)較小。近1個(gè)月有全身性過(guò)敏反應(yīng)(可使皮膚暫時(shí)無(wú)反應(yīng))及一些藥物會(huì)造成假陰性結(jié)果，故試驗(yàn)前應(yīng)停用抗組胺藥物4～5 d，且3周內(nèi)避免在進(jìn)行皮膚測(cè)試的地方使用皮質(zhì)類固醇[1]。因過(guò)敏原直接作用于人體，有發(fā)生過(guò)敏性休克的風(fēng)險(xiǎn)，哮喘急性期、強(qiáng)烈的過(guò)敏發(fā)作期以及不配合的兒童不適合做點(diǎn)刺試驗(yàn)[3]。另外，SPT的結(jié)果判斷受技術(shù)和所用試劑的影響[2]，其傳統(tǒng)的致敏劑是天然過(guò)敏原提取物，目前已有重組或高純度的致敏蛋白標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于臨床[4]。

1.1.2 皮內(nèi)試驗(yàn) 皮內(nèi)試驗(yàn)是將比SPT更低濃度和劑量的過(guò)敏原提取物注射至皮內(nèi)，15～20 min后讀取結(jié)果。既可用于評(píng)價(jià)IgE介導(dǎo)的速發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，也可用于評(píng)價(jià)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。主要適用于疑似呼吸道過(guò)敏但SPT陰性、毒液和藥物過(guò)敏的病例[1]。皮內(nèi)試驗(yàn)的禁忌證與SPT無(wú)異，為安全起見(jiàn)，皮內(nèi)試驗(yàn)前必須先行SPT，與SPT相比，其具有更高的敏感性和更低的特異性[1]，但其發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)更大也更嚴(yán)重。

1.1.3 特應(yīng)性斑貼試驗(yàn)(atopy patch test，APT) APT是通過(guò)患者的皮膚長(zhǎng)時(shí)間(通常為48 h)暴露于接觸性變應(yīng)原，誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[1]，常在第72小時(shí)解讀反應(yīng)結(jié)果，是診斷過(guò)敏性接觸性皮炎的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，但近期才被用于評(píng)估食物過(guò)敏。因其安全性高，兒童也推薦使用[6]。此法適用于懷疑潛在或繼發(fā)性過(guò)敏性接觸性皮炎的患者[6]；或SPT和sIgE均陰性但懷疑有過(guò)敏反應(yīng)者；或多種sIgE(+)，但無(wú)法證實(shí)與臨床關(guān)聯(lián)的特應(yīng)性皮炎患者[3]；或食物過(guò)敏中懷疑為遲發(fā)型反應(yīng)者[7]。對(duì)于牛奶和雞蛋過(guò)敏，APT聯(lián)合sIgE檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)期值達(dá)到94%以上，無(wú)需食物激發(fā)試驗(yàn)再進(jìn)一步確診[8]。

該方法中，接受全身皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢素或霉酚酸酯等免疫抑制劑治療者可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，但抗組胺藥物對(duì)結(jié)果無(wú)干擾[5]。對(duì)APT部位進(jìn)行局部皮質(zhì)類固醇、局部鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑或紫外線照射可抑制斑貼試驗(yàn)反應(yīng)，故APT前5～7 d內(nèi)不應(yīng)涂抹皮質(zhì)類固醇或鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，APT前2～4周不要曬黑或日光浴[5]。APT目前在國(guó)際上已有4 000多種變應(yīng)原，對(duì)特應(yīng)性皮炎的診斷有重要意義。但APT易受抗原濃度過(guò)低、受試者皮膚反應(yīng)性下降、方法學(xué)的錯(cuò)誤等影響，據(jù)估計(jì)，其假陰性結(jié)果高達(dá)30%[5]，對(duì)特應(yīng)性皮炎檢測(cè)的陽(yáng)性率低于SPT和體外實(shí)驗(yàn)，但其與臨床病史有顯著相關(guān)性，特異性更好。

1.2 口服食物激發(fā)試驗(yàn) 口服食物激發(fā)試驗(yàn)是診斷食物過(guò)敏的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，由于皮膚試驗(yàn)和過(guò)敏原sIgE檢測(cè)不能將“敏化”與“過(guò)敏”區(qū)分開(kāi)，常需口服食物激發(fā)試驗(yàn)來(lái)證實(shí)或排除食物過(guò)敏或其是否消退。本試驗(yàn)需在醫(yī)院內(nèi)進(jìn)行，需準(zhǔn)備好急救藥物和設(shè)備；食物過(guò)敏原一般從10 mg開(kāi)始給予，如未出現(xiàn)有關(guān)過(guò)敏癥狀，則每隔15～60 min將劑量加倍，直到增至8～10 g。若試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)速發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)，或特應(yīng)性皮炎積分指數(shù)增加10分以上為陽(yáng)性；若無(wú)癥狀出現(xiàn)，則可排除該食物過(guò)敏[3]。該試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)較大，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)；檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、昂貴、費(fèi)力、需要專門(mén)的環(huán)境，而且激發(fā)試驗(yàn)的方案一直無(wú)法完全標(biāo)準(zhǔn)化，臨床應(yīng)用較少。

2 體外檢測(cè)方法

2.1 血清總IgE和sIgE IgE檢測(cè)是評(píng)估可疑過(guò)敏反應(yīng)的基本方法[1]，較體內(nèi)檢測(cè)方法更安全、簡(jiǎn)單、不受抗組胺藥物影響，具有重復(fù)性強(qiáng)、精確性高和可定量等優(yōu)點(diǎn)，但不同試劑和生產(chǎn)商之間的結(jié)果存在較大差異[10]。對(duì)于兒童患者，不同年齡的血清IgE水平有明顯差異，臍帶血IgE水平很低(<0.5 IU/mL)，出生后隨年齡增長(zhǎng)而逐漸升高，12歲時(shí)達(dá)成人水平(20～200 IU/mL)，一般認(rèn)為>333 IU/mL時(shí)為異常升高。但總IgE只是對(duì)過(guò)敏性疾病的粗略判斷，總IgE增高也可見(jiàn)于除過(guò)敏外的其他疾病：如寄生蟲(chóng)感染、支氣管肺曲霉菌病、部分吸煙者、多發(fā)性骨髓瘤、某些原發(fā)性免疫缺陷(X連鎖免疫失調(diào)內(nèi)分泌腸病綜合征、Omenn綜合征、Wiskott-Aldrich綜合征、Comel-Netherton綜合征和高IgE綜合征)等[11]。反之，總IgE正?；驕p少并不能排除過(guò)敏[1]。一些樣本量較大或研究人群同質(zhì)性更強(qiáng)的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生特異性IgE濃度更高的患者發(fā)生重度反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)更大[12]，但靶器官敏感性差異、患者的一般健康狀態(tài)、變應(yīng)原攝入量等相關(guān)因素影響，其實(shí)血清sIgE濃度不能可靠地預(yù)測(cè)反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

2.1.1 sIgE的單一檢測(cè)分析 sIgE的檢測(cè)主要通過(guò)免疫方法，包括免疫熒光法、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、熒光酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光分析或放射過(guò)敏吸附分析等[13]。免疫熒光法檢測(cè)總IgE和sIgE是國(guó)際上體外過(guò)敏原診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。國(guó)內(nèi)IgE檢測(cè)主要是免疫熒光法(phadia)、免疫印跡法(敏篩、歐蒙、浙大迪訊等)和酶聯(lián)免疫吸附法(浩歐博、浙大迪訊等)，三者在過(guò)敏原檢測(cè)種類、用血量方面均明顯提升。目前國(guó)內(nèi)唯一提供定量檢測(cè)的方法是免疫熒光法，其過(guò)敏原檢測(cè)種類在2019年已更新至31種，用血量40 μL血清/種，但其價(jià)格偏高。免疫印跡法，一般為成套檢測(cè)，分食物過(guò)敏套餐、吸入過(guò)敏套餐和食物吸入套餐等，組合項(xiàng)目有29項(xiàng)，包含過(guò)敏原60種，用血量300 μL血清/項(xiàng)，因其通量大，價(jià)格適中，用血量少，具有極高的特異性和敏感度，在國(guó)內(nèi)使用最廣泛。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)sIgE較免疫印跡法價(jià)格貴、檢測(cè)項(xiàng)目偏少，共有18個(gè)組合項(xiàng)目，用血量200 μL血清/項(xiàng)，但其可于體外定量檢測(cè)血清特異性IgG濃度，臨床上更常用于輔助診斷IgG介導(dǎo)的食物不耐受。

2.1.2 sIgE的多重分析 變應(yīng)原微陣列，近年來(lái)已在國(guó)外廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)也已引進(jìn)相應(yīng)設(shè)備和試劑，其優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)、高效、精準(zhǔn)、高通量平行檢測(cè)、結(jié)果可靠[3],但可導(dǎo)致臨床的過(guò)度診斷[14]。已應(yīng)用于臨床的是免疫固相變應(yīng)原芯片系統(tǒng)，其包含112種過(guò)敏原。還在開(kāi)發(fā)的有歐洲的MeDALL芯片(含170種過(guò)敏原)、澳大利亞的Alex(含有282種試劑，包含157種過(guò)敏原提取物和125種重組或高度純化的致敏蛋白)。變應(yīng)原微陣列還可評(píng)估除血清或血漿外的液體中特異性IgE的情況[1]。如免疫固相變應(yīng)原芯片在春季角結(jié)膜炎患者淚液中檢測(cè)到食物過(guò)敏原sIgE，甚至有些是血清中沒(méi)有的sIgE[15]。另外，Schmid等[16]觀察到治療前過(guò)敏原sIgE可能控制IgG4的誘導(dǎo)，而在增加皮下免疫治療劑量后，免疫固相變應(yīng)原芯片測(cè)得sIgE水平明顯降低，IgG4水平升高，提示可通過(guò)sIgE水平評(píng)估免疫治療療效。免疫固相變應(yīng)原芯片由于能同時(shí)檢測(cè)sIgE和過(guò)敏原特異性IgG4[17]，而被認(rèn)為也是過(guò)敏原免疫治療的療效監(jiān)測(cè)手段。

2.1.3 (變應(yīng)原)組分解析診斷 也稱“分子變應(yīng)原”診斷法，與傳統(tǒng)sIgE檢測(cè)方法不同，其變應(yīng)原是通過(guò)液相色譜/質(zhì)譜等技術(shù)純化天然過(guò)敏原[18]或通過(guò)重組技術(shù)獲得的單一蛋白或多肽組分[19]，而非提取物整體，避免一些同源蛋白的交叉反應(yīng)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，但不具有臨床意義，卻造成食物過(guò)敏的過(guò)度診斷。組分解析診斷有助于提高檢測(cè)的特異性，建立個(gè)體的初級(jí)和交叉反應(yīng)致敏譜[20]，定制更詳細(xì)的不同過(guò)敏原的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，幫助制定飲食建議，減少患者不必要的飲食回避。但目前只有吸入性變應(yīng)原和1種食物(榛子)變應(yīng)原應(yīng)用于市場(chǎng)，組分解析診斷的大多數(shù)變應(yīng)原仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段[18]。

2.2 嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)(basophil activation test，BAT) 嗜堿性粒細(xì)胞是可從外周血中獲取的特異性致敏效應(yīng)細(xì)胞，是研究sIgE/FcεRI依賴的脫顆粒作用的良好對(duì)象[1]。最常見(jiàn)的BAT是直接用抗原激活嗜堿性粒細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞上特定表面抗原如CD63、CD203c的表達(dá)，或測(cè)定其活化后脫顆粒產(chǎn)生的活性物質(zhì)(主要是組胺)[21]。但約10%的細(xì)胞捐贈(zèng)人群有“無(wú)能”嗜堿性細(xì)胞，即BAT中的無(wú)反應(yīng)者[22]。為識(shí)別這些無(wú)反應(yīng)者，需抗IgE或抗-FcεRI作為BAT的陽(yáng)性對(duì)照[23]，而試驗(yàn)結(jié)果評(píng)估的最佳指標(biāo)是CD63+/抗-FcεRI比值[24]或曲線下面積[25]。

BAT可用于評(píng)價(jià)IgE介導(dǎo)及非IgE介導(dǎo)的(類)過(guò)敏反應(yīng)[26]，診斷各種吸入性過(guò)敏原(花粉、屋塵螨和貓屑)、食物(包括與花粉有關(guān)的食物過(guò)敏)、天然膠乳、昆蟲(chóng)毒液、某些藥物(主要是箭毒和β-內(nèi)酰胺類抗生素)引起的過(guò)敏性疾病及有抗FcεRI或抗IgE自身抗體的慢性蕁麻疹[19,23]，甚至可作為脫敏治療的療效指標(biāo)[23]。因?yàn)槭葔A性粒細(xì)胞活化是一種生物學(xué)反應(yīng)，且不受抗組胺藥物影響，BAT陽(yáng)性可說(shuō)明臨床過(guò)敏，診斷的準(zhǔn)確性高于皮膚試驗(yàn)及sIgE檢測(cè)[27]，安全性高于激發(fā)試驗(yàn)及斑貼試驗(yàn)。BAT可識(shí)別不同嚴(yán)重程度的過(guò)敏表型，如牛奶過(guò)敏更持久且更嚴(yán)重者的嗜堿性粒細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)牛奶的反應(yīng)更強(qiáng)[28]；BAT可區(qū)分牛奶過(guò)敏兒童中哪些仍存在過(guò)敏，哪些過(guò)敏反應(yīng)已隨年齡增長(zhǎng)消失但仍存在敏化[29]。但BAT檢測(cè)技術(shù)難度大，雖然已有商業(yè)化檢測(cè)試劑盒問(wèn)世，但對(duì)其結(jié)果的界定和解釋尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，尚需繼續(xù)的研究和開(kāi)發(fā)[1]。

2.3 嗜酸性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP) 活化的嗜酸性粒細(xì)胞是遲發(fā)相Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的主要細(xì)胞，ECP是其釋放的最具細(xì)胞毒性的生物活性蛋白[3]，過(guò)敏患者的ECP水平在予抗過(guò)敏藥物或特應(yīng)性免疫治療時(shí)會(huì)明顯下降[30]。雖然ECP水平易受性別、種族、吸煙習(xí)慣、寄生蟲(chóng)和藥物等混雜因素的影響[30]，不適用于過(guò)敏原的篩查，但ECP可作為過(guò)敏性疾病病情活動(dòng)與治療療效的指標(biāo)[3]。酶聯(lián)免疫吸附法常用于測(cè)定血液、痰液等標(biāo)本中的ECP水平，其成本低、簡(jiǎn)便、快捷、不需特殊儀器。

過(guò)敏原檢測(cè)方法在臨床應(yīng)用時(shí)需考慮以下三點(diǎn):患者個(gè)體情況、懷疑的發(fā)病機(jī)制(IgE或非IgE介導(dǎo))及各種檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)與局限性，選出最合適的檢測(cè)手段。無(wú)論用哪種過(guò)敏原檢測(cè)方法，都需要結(jié)合病史和體格檢查來(lái)診斷。為了確定食物過(guò)敏的嚴(yán)重程度、區(qū)分敏化與臨床過(guò)敏和評(píng)估療效，更好地診治過(guò)敏性疾病，還需改進(jìn)現(xiàn)有檢測(cè)方法或開(kāi)發(fā)新的方法。