楊 帆，王宇波，張小琦，趙梅平，朱 梅

陜西省漢中市中心醫(yī)院產(chǎn)科，陜西漢中 723000

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，由于其缺乏可靠的早期篩查診斷方法，確診時(shí)多為晚期[1]。因此，卵巢癌在婦科腫瘤中病死率最高，晚期患者術(shù)后5年生存率低于30%?，F(xiàn)階段治療卵巢癌以外科手術(shù)切除病灶為主，輔以紫杉醇類藥物及鉑類藥物化療、放療、靶向藥物等治療[2]。然而，即使化療藥物初期效果明顯，但大部分患者仍會(huì)出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)等情況[3]。由于線粒體可獨(dú)立合成電子傳遞鏈復(fù)合體中的13種蛋白，進(jìn)而與細(xì)胞核編碼的蛋白共同完成線粒體相關(guān)的多種生命活動(dòng)，因此，線粒體又是細(xì)胞內(nèi)唯一一種半自主細(xì)胞器[4]。與真核細(xì)胞質(zhì)中翻譯體系類似,線粒體基因的翻譯系統(tǒng)也包括信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(tRNA)、核糖體及翻譯所需的起始因子等[5]。氨酰-tRNA合成酶是生命進(jìn)化過程中最早出現(xiàn)的一類蛋白質(zhì)，主要負(fù)責(zé)將氨基酸結(jié)合到其對(duì)應(yīng)的tRNA上，進(jìn)而完成蛋白質(zhì)的合成[6]。放療可增加線粒體翻譯，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體的呼吸能力和線粒體三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生，從而更有效地修復(fù)輻射誘導(dǎo)的DNA損傷[7]。因此，抑制線粒體翻譯系統(tǒng)可能是一種有效抑制腫瘤惡性進(jìn)展的新手段[8]。本研究以天冬酰胺基-線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶2(NARS2)為代表，研究其在卵巢癌組織中的表達(dá)及生物學(xué)意義，進(jìn)而為開發(fā)卵巢癌的新型預(yù)后生物標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)提供理論線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2008-2017年卵巢癌患者組織標(biāo)本244例，皆為術(shù)中取得后立即置于液氮保存。標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初治患者均行手術(shù)治療；(2)組織病理學(xué)檢查為卵巢癌；(3)病理切片通過2位獨(dú)立的病理醫(yī)師重新評(píng)估。此外，本研究還選取了本科室實(shí)驗(yàn)室保存的正常卵巢上皮組織標(biāo)本9例。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué) 采用EnVisionTM(K5007，DAKO)免疫組織化學(xué)試劑盒開展試驗(yàn)，具體步驟如下：將上述卵巢癌及正常卵巢組織切片，60 ℃拷片后經(jīng)脫蠟水化，再行檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液抗原修復(fù)，利用3% H2O2失活內(nèi)源過氧化氫酶，隨后加正常山羊血清于28 ℃進(jìn)行封閉，加入稀釋好的兔源NARS2多克隆抗體(ab254714，Abcam)于濕盒中4 ℃過夜。PBS清洗后加二抗在37 ℃條件下放置20 min，滴加DBA工作液顯色，之后放入蘇木精染液中復(fù)染5 min，再次清洗、分化，乙醇脫水。顯微鏡(CX41，奧林巴斯)下對(duì)切片進(jìn)行觀察拍照。免疫組織化學(xué)結(jié)果量化標(biāo)準(zhǔn)：(1)陽性率，1分為陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的25%以下,2分為25%～50%，3分為>50%～75%，4分為75%以上；(2)顯色強(qiáng)度評(píng)分，0 分為無著色,1 分為淺黃色,2 分為棕黃色,3 分為棕褐色。最終總評(píng)分為(1)、(2)的乘積。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3購于美國ATCC細(xì)胞庫并由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)液氮保存。培養(yǎng)時(shí)采用加入10%胎牛血清(四季青生物)的RPMI-1640培養(yǎng)液(上海生工生物)，培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度為5%，溫度為37 ℃。

1.2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 采用匯合率為70%的處于對(duì)數(shù)期的SKOV-3人卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液后每皿加入 1.5 mL RPMI-1640培養(yǎng)液及0.5 mL pcDNATM3.1-NARS2質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)與lipofectamine 2000混合的轉(zhuǎn)染復(fù)合物液。輕輕混勻，孵育箱中培養(yǎng) 6 h后更換培養(yǎng)基。用G418篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot) 采用RIPA蛋白裂解液裂解SKOV-3細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，加入上樣緩沖液后煮沸5 min。而后行聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h后，依次加入用5%脫脂奶粉稀釋過的NARS2(ab254714，Abcam)、Cleaved-Caspase3(ab2302，Abcam)、Cleaved-Caspase9(ab2324，Abcam)及β-actin抗體于4 ℃孵育過夜，用TPBS洗膜3次后加入二抗并在室溫下繼續(xù)1 h，用TPBS洗膜3次后采用化學(xué)發(fā)光法對(duì)條帶進(jìn)行發(fā)光顯色。

1.2.5線粒體氧耗速率測定 參照使用說明書，在Seahorse細(xì)胞能量代謝分析儀(Seahorse Bioscience XF-24)測定氧耗速率。線粒體ATP合酶抑制劑：寡霉素[Oligomycin(495455)]；氧化磷酸化解耦聯(lián)劑：三氟甲氧基苯腙羰基氰化物[FCCP(C2920)]；傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ抑制劑：魚藤酮[Rotenone(R8875)]；電子傳遞阻斷劑：抗霉素[A(D8815)]購于默克公司并保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2.6線粒體復(fù)合體活性測定 參照使用說明書，使用Complex Ⅰ(ab109721，Abcam)、Complex Ⅲ(ab109908，Abcam)、Complex Ⅳ(ab109911，Abcam)活性檢測試劑盒檢測各復(fù)合體活性。

1.2.7細(xì)胞凋亡測定 消化計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入100 μL PBS重懸，加入Annexin-V 染液，室溫下避光孵育20 min，PBS清洗后，碘化丙啶(PI)染色10 min，PBS清洗后，400 μL PBS重懸，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比例。

2 結(jié) 果

2.1NARS2在卵巢癌組織中的表達(dá) 首先采用免疫組織化學(xué)法檢測卵巢癌及正常卵巢組織中NARS2的表達(dá)變化，見圖1A、1B。正常卵巢組織(n=9)中NARS2的免疫組織化學(xué)評(píng)分最高為8分，最低為0分，平均(4.40±0.80)分。而在卵巢癌組織(n=244)中NARS2的免疫組織化學(xué)評(píng)分最高為12分，最低為0分，平均(7.95±0.37)分。卵巢癌組織中NARS2的免疫組織化學(xué)評(píng)分明顯高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.08，P=0.002 8)。

2.2NARS2表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 將244例卵巢癌組織按NARS2免疫組織化學(xué)評(píng)分分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并進(jìn)行Kapla-Meier生存分析，見圖2。高表達(dá)組預(yù)后明顯差于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。腫瘤組織中高表達(dá)NARS2是較差預(yù)后因素，高表達(dá)與患者生存期縮短明顯相關(guān)。

圖2 NARS2表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后

2.3NARS2高表達(dá)明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞氧化呼吸功能 NARS2高表達(dá)可明顯提高卵巢癌細(xì)胞線粒體基礎(chǔ)呼吸速率、添加寡霉素質(zhì)子泵抑制劑阻斷ATP合酶后的質(zhì)子泄漏耗氧速率及FCCP處理后線粒體最大氧耗速率(圖3A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NARS2的高表達(dá)可明顯促進(jìn)線粒體復(fù)合體Ⅰ及復(fù)合體Ⅳ的活性(圖3B)。

注：A為H&E染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；B為免疫組織化學(xué)評(píng)分。圖1 卵巢癌和正常卵巢組織中NARS2的免疫組織化學(xué)評(píng)分

2.4NARS2高表達(dá)明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡抵抗能力 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示(圖4A、4B)，經(jīng)氧化磷酸化的解耦聯(lián)劑FCCP處理可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，而NARS2的高表達(dá)可明顯減少FCCP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[(29.67±1.44)%vs.(51.07±1.10)%,P=0.000 3]。進(jìn)一步Western blot結(jié)果顯示(圖4C)，NARS2的高表達(dá)可明顯減少CCCP誘導(dǎo)的Caspase 3和Caspase 9的切割。

注：A為線粒體氧耗速率檢測，Oligomycin為寡霉素質(zhì)子泵抑制劑，F(xiàn)CCP為氧化磷酸化的解耦聯(lián)劑,Rotenone為魚藤酮復(fù)合體1抑制劑，antimycinA為抗霉素A復(fù)合體3抑制劑；B為線粒體復(fù)合體活性檢測；與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖3 NARS2高表達(dá)對(duì)線粒體功能的影響

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；B為細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果；C為Western blot 檢測結(jié)果；與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖4 NARS2高表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的重要細(xì)胞器，并在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、穩(wěn)態(tài)維持和細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[9]。此外，線粒體還擁有獨(dú)立于細(xì)胞核的DNA，負(fù)責(zé)編碼對(duì)線粒體正常功能至關(guān)重要的呼吸鏈亞基[10]。大部分腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的線粒體代謝特征，并依賴線粒體呼吸提供能量。而抑制線粒體翻譯功能則可導(dǎo)致線粒體呼吸受損及線粒體功能障礙，并被證實(shí)是消除實(shí)體瘤及腫瘤干細(xì)胞的有效手段[8]。例如，Tigecycline是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的具有有效抗癌活性的抗菌藥物。Tigecycline除通過抑制Wnt/β-catenin和誘導(dǎo)自噬外，還可直接與線粒體核糖體結(jié)合并抑制線粒體翻譯，起殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[11]。

NARS2基因編碼NARS2是核編碼的線粒體酰氨基tRNA合成酶之一，對(duì)維持線粒體功能至關(guān)重要[6]。NARS2基因產(chǎn)物可催化特定氨基酸與其相關(guān)的tRNA的結(jié)合，是線粒體蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵步驟。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，NARS2基因突變與癲癇、腦萎縮[12]、阿爾珀斯綜合征[13]、嬰兒神經(jīng)退行性疾病[14]的發(fā)作密切相關(guān)。然而，有關(guān)NARS2基因異常與人類腫瘤的關(guān)系少見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，NARS2免疫組織化學(xué)評(píng)分在卵巢癌組織中明顯高于正常卵巢組織，且腫瘤組織中NARS2高表達(dá)的患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)者。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NARS2可明顯促進(jìn)線粒體的呼吸功能、電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ及Ⅳ的活性，并且明顯提高卵巢癌細(xì)胞的抗凋亡能力。與本研究結(jié)果相類似，SIMON等[15]在研究非綜合征性耳聾和李氏綜合征時(shí)發(fā)現(xiàn)，在HEK293T細(xì)胞中敲除NARS2可導(dǎo)致線粒體氧耗速率和電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性明顯降低，恢復(fù)NARS2表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)上述表型。

NARS2有望成為一種新型卵巢癌患者預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn),但其致病機(jī)制未闡明。因此可預(yù)見，探索NARS2在包括惡性腫瘤在內(nèi)的各種人類疾病中的異常狀態(tài)、關(guān)鍵生物學(xué)功能及其潛在分子生物學(xué)機(jī)制，可能是基礎(chǔ)及臨床醫(yī)學(xué)的下一個(gè)研究熱點(diǎn)。