何舒瀾，李泳寧，朱扶蓉

（福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，福建 福州 350101）

0 引言

【研究意義】畬藥十二時辰是福建地區(qū)民間常用中草藥之一，在福安等地多見，其藥性辛溫，辛可活血通絡(luò)，溫可散寒除濕，亦可利水，常用于治療二便不通、婦女閉經(jīng)、風濕痹痛等疾病[1]。畬藥十二時辰的基原植物來源于毛茛科重瓣綠花鐵線蓮（Clematis florida Thunb.Var.plena D.Don），也稱為閩產(chǎn)重瓣鐵線蓮[2]。畬藥十二時辰以基原植物的根入藥，但多種植物的地下部分在外觀與色澤方面與其十分相似，給準確鑒別畬藥十二時辰帶來困難。傳統(tǒng)中草藥的真?zhèn)舞b別常采用性狀、顯微等方法進行，對混淆品鑒別的精度有限，常無法準確地判斷混淆品的基原，因此探索一種快速、準確鑒別畬藥十二時辰基原的方法迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M展】目前對畬藥十二時辰的研究主要集中在對其成分的提取方法優(yōu)化、化學成分分析、毒性研究、藥效機制研究等方面[3?6]，對其真?zhèn)舞b別的研究依然停留在性狀鑒別與顯微鑒別層面[7]。近年來隨著分子生物學的快速發(fā)展，中草藥的鑒定開始走向分子水平[8?13]，為畬藥十二時辰開展分子生藥學研究提供了可能?！颈狙芯壳腥朦c】要開展畬藥十二時辰的分子鑒定首先需要對其基因組DNA進行提取，目前通過分子生藥學方法鑒別畬藥十二時辰的真?zhèn)熙r有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗擬優(yōu)選提取畬藥十二時辰DNA的最佳方法，并通過真?zhèn)纹稤NA的雙向測序，實現(xiàn)真品與常見混淆品的準確區(qū)分，為進一步開 發(fā)應(yīng)用該福建地區(qū)特色中草藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

畬藥十二時辰基原植物（閩產(chǎn)重瓣鐵線蓮）種植于福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院藥用植物園，經(jīng)中藥教研室鑒定為毛茛科重瓣綠花鐵線蓮。剪取該植物新長出的幼嫩葉片，作為基因組DNA提取的材料。十二時辰混淆品基原植物購自福建某農(nóng)產(chǎn)品市場，取殘留的葉片作為混淆品基原植物DNA提取的材料。

主要儀器：臺式冷凍離心機（湘儀）、電泳儀（北京六一）、精密pH計（雷磁）、PCR儀（珠海黑馬）、凝膠成像系統(tǒng)（珠海黑馬）、恒溫水浴箱（J-MAX）、恒溫箱（北京六一）、酶標儀EPOCH2（美國伯騰儀器有限公司）、高速離心機HC-2062（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。主要試劑：瓊脂糖（西班牙Biowest）、EDTA（美國Sigma）、Tris（美國Sigma）。引物由北京擎科生物提供。植物基因組DNA提取試劑盒CW0553（ 北京康為世紀）。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

（1）CTAB法 取新鮮葉200 mg，液氮粉碎，加入CTAB緩沖液，水浴60 min后加入等體積氯仿-異戊醇（24∶1），4 ℃離心后取上清液加入異丙醇繼續(xù)離心，沉淀加入75%乙醇后再次離心，沉淀物晾干后加入200 μL TE緩沖液，?20 ℃下保存，編號樣品1。

（2）改良CTAB法 取新鮮葉200 mg，液氮粉碎，加2%CTAB裂解液震蕩后，加入β-巰基乙醇和2%pvp各20 μL后震蕩，65 ℃水浴60 min，加入酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），4 ℃離心后取上清液加入等體積氯仿-異戊醇（24∶1），4 ℃再次離心后取上清液，加入預(yù)冷的醋酸鈉和異丙醇，?20 ℃放置60 min后4 ℃離心，沉淀75%乙醇洗滌后晾干，加入200 μL TE緩沖液顛倒混勻，?20 ℃下保存，編號樣品2。

（3）試劑盒法 取新鮮葉200 mg，液氮粉碎，按照說明書進行提取，提取物編號樣品3。

（4）SDS法 取新鮮葉200 mg，液氮粉碎，加入800 μL 10%SDS裂解液，18 μL巰基乙醇，4 mL RnaseA和0.03 g pvp，65 ℃水浴60 min后加入800 μL氯仿-異戊醇（24∶1），4 ℃離心后取上清液加入等體積預(yù)冷的異丙醇，?20 ℃放置30 min，4 ℃離心，沉淀75%乙醇洗滌后晾干，加入200 μL TE緩沖液顛倒混勻，?20 ℃下保存，編號樣品4。

（5）高鹽低pH法 取新鮮葉200 mg，液氮粉碎后迅速加入1 mL65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液，65 ℃水浴120 min后離心，取上清液加入2/3體積KAC（醋酸鉀），置冰中30 min后再次離心，上清液加入氯仿-異戊醇后再離心，上清液加入2/3體積預(yù)冷異丙醇，離心收集沉淀；加無菌水溶解，離心，用乙醇洗滌后干燥，加200 μL TE緩沖液，?20 ℃下儲存 ，編號樣品5。

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測

（1）瓊脂糖凝膠電泳 取5種方法提取的DNA各5 μL，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120 V、20 min），凝膠成像儀采集照片，考察提取得到的基因組DNA的完整性。

（2）酶標儀測定 通過酶標儀測定樣品DNA在260 nm和280 nm處的OD值，根據(jù)OD260/280的值判斷提取基因組DNA的純度。

（3）PCR擴增分析 SSR引物的篩選：選取11對引物[14]，具體信息見表1，對樣品基因組DNA進行擴增分析。SSR擴展反應(yīng)體系包含模板DNA 2 μL，引物各1 μL，2×Es Taq Master Mix 15 μL，ddH2O 11 μL，總體積為30 μL。擴增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，后進行40個循環(huán)，含94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增結(jié)束后72 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物電泳選用1×TAE配制2%瓊脂糖凝膠，灌膠前加入0.5 μL EB使終濃度為0.5 μg·mL?1；4.5 μL PCR產(chǎn)物中加入0.5 μL 10×loading buffer，上樣。150 V恒壓電泳。溴酚藍遷移至電泳膠2/3處停止電泳；凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄試驗結(jié)果，根據(jù)擴增效果選擇4種引物用于后續(xù)試驗。

SSR引物擴增分析：不同提取方法提得的基因組DNA用SSR引物篩選得到的4種引物進行擴增分析，SSR擴展反應(yīng)體系、擴增條件、瓊脂糖電泳法與1.2.2中PCR擴增分析項下SSR引物篩選條件相同，觀察并記錄試驗結(jié)果。

表 1 引物信息Table 1 Information on primer

ITS2序列擴增分析：以所提取的基因組DNA為模板，利用引物P1：5′－AGAAGTCGTAACAAGGT TTCCGTAGG－3′，P4：5′－TCCTCCGCTTATTGAT ATGC－3′進行擴增鑒定[15]，ITS2引物PCR反應(yīng)體系包含模板DNA 2 μL，引物各1 μL，2×Es Taq Master Mix 15 μL，ddH2O 11 μL，總體積為30 μL。擴增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，后進行35個循環(huán)，含94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，擴增結(jié)束后72 ℃終延伸10 min。用1×TAE配制2%瓊脂糖凝膠，灌膠前加入0.5 μL EB使終濃度為0.5 μg·mL?1；4.5 μL反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.5 μL 10×loading buffer，上樣。150 V恒壓電泳。溴酚藍遷移至電泳膠2/3處停止 電泳；凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄試驗結(jié)果。

1.2.3 分子生藥學鑒別

（1）DNA的提取 綜合1.2.1與1.2.2的結(jié)果，選取最合適的提取方法提取畬藥十二時辰基原植物基因組DNA，編號樣品6。同法提取常見混淆品葉片的DNA，編號樣品7。

（2）PCR擴增 對樣品6與樣品7進行PCR擴增，選用引物及條件同1.2.2中PCR擴增分析項下ITS2序列擴增分析，產(chǎn)物進行雙向測序。

（3）序列拼接與分析 測序得到的序列進行拼接及人工校對，根據(jù)GenBank中相似度最高物種的ITS序列邊界，截取待鑒定樣本的ITS序列。根據(jù)文獻[16]，被子植物大多數(shù)科屬其ITS序列的種間差異值為1.2%～10.2%，屬間差異值為9.6%～28.8%，相似度＞98%可作為種的溯源依據(jù)，通過相似度分析和DNA條形碼溯源鑒定畬藥十二時辰藥材及混淆品的 基原植物來源。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠電泳檢測

如圖1顯示，試劑盒法提取的DNA電泳完整，亮度較高；改良CTAB法提取的DNA電泳也較完整，亮度也高，與試劑盒法效果相近，CTAB法提取的DNA雖有一定拖尾，但帶型尚可，亮度也較高；高鹽低pH法提取的DNA雖然帶型單一，但亮度較暗；SDS法提取的DNA存在拖尾，且亮度較暗?？梢奡DS法提得的DNA最不理想，因此選擇CTAB法、改良CTAB法、高鹽低pH法、試劑盒法4種方法 進行后續(xù)試驗。

2.2 酶標儀檢測DNA的純度

當OD260/280介于1.70～1.90時，表示提取DNA的純度較高，質(zhì)量較好，若低于1.70或高于1.90則表示DNA降解或受到糖類、蛋白質(zhì)、RNA的污染[17]。由表2可見，試劑盒法與改良CTAB法提得的DNA純度較高，質(zhì)量較好；高鹽低pH法提得的DNA純度 稍差，SDS法提得的DNA純度最差。

圖 1 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of DNA

表 2 DNA的OD260/280與模板濃度Table 2 OD260/280 and template concentration of DNA

2.3 11種引物的SSR擴增產(chǎn)物電泳

圖2顯示，11種引物A～K均能在基因組DNA中得到擴增，根據(jù)條帶的明亮清晰及位置，選擇A、E、F、J四種引物進行后續(xù)試驗。

圖 2 11種引物擴增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of 11 primers after amplification

2.4 不同DNA提取方法的SSR擴增產(chǎn)物電泳

圖3顯示，CTAB法、改良CTAB法、試劑盒法提取得到的基因組DNA使用引物A、E、F、J進行擴增，均能得到清晰的片段，但用高鹽低pH法提取得到的基因組DNA使用引物A、E、F、J進行擴增 ，均未出現(xiàn)條帶。

2.5 ITS2序列擴增產(chǎn)物電泳

圖4顯示，用試劑盒法、改良CTAB法、CTAB法提得的基因組DNA均能完全擴增，條帶清晰明亮。但高 鹽低pH法提得的DNA無法擴增，未顯示出條帶。

2.6 生藥學鑒別結(jié)果

如圖5顯示，樣品6與樣品7進行PCR擴增后條帶清晰。樣品6擴增測序后將拼接后截取好的十二時辰序列輸入GenBank 中進行BLAST比對，相似度超過99.5%有3個，分別為Clematis florida（AB 120186.1）、Clematis florida（KC004031.1）、Clematis florida（AB775160.1），驗證結(jié)果可靠，表明使用篩選方法所提取的十二時辰原植物基因組DNA能用于該品種的分子生藥學實驗并準確鑒別十二時辰（重瓣鐵線蓮）真品。樣品7擴增測序、拼接后截取的ITS 序列相同，輸入GenBank 中進行BLAST比對，相似度大于98.5%的有Ardisia pusilla（MF682166.1）與Ardisia pusilla（FJ482140.1）。混淆品為紫金?？频木殴?jié)龍。如圖6顯示，通過分子生藥學鑒別，能準確鑒別畬藥十二時辰真品與混淆品。

圖 3 SSR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of SSR amplification products

圖 4 ITS2擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of ITS2 amplification products

圖 5 樣品6與樣品7的ITS2擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 5 Agarose gel electrophoresis on ITS2 products of Sample 6 and 7

畬藥十二時辰可通經(jīng)絡(luò)，在福建福安等地常用于治療跌打損傷，而混淆品九節(jié)龍的根也被用于治療跌打損傷[18]，且兩者的根比較相似，容易造成混淆。傳統(tǒng)的生藥學鑒定除性狀鑒定外，一般需要制作粉末臨時標本片及組織切片進行顯微鑒定，操作步驟繁瑣且顯微鑒定依然無法解決真?zhèn)纹返幕瓎栴}，基原鑒定傳統(tǒng)上依然需要經(jīng)過實地走訪調(diào)研、采集植物標本、觀察植物器官，比對數(shù)據(jù)庫文獻及實物標本等步驟。隨著分子生藥學的發(fā)展，通過DNA鑒定來準確便捷地鑒別真?zhèn)纹返幕瑹o疑對中草藥的真?zhèn)舞b別更有價值。

圖 6 16Sr DNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of 16Sr DNA gene sequence

近年來，對植物DNA提取的報道很多[19?23]，均能有效地提取到植物的基因組DNA，但由于畬藥十二時辰中含有大量的蛋白質(zhì)，多酚，多糖等成分，給高質(zhì)量基因組DNA的提取增加了困難。在本試驗中，畬藥十二時辰新鮮葉片采用CTAB法、改良CTAB法、CW0553試劑盒法均可提得滿足后續(xù)分子生物學試驗需要的基因組，但高鹽低pH法與SDS法并不適用。SDS法提得的基因組DNA的純度和濃度都很低，可能與提取過程中DNA出現(xiàn)降解有關(guān)。而高鹽低pH法在使用文中不同引物時都無法實現(xiàn)擴增，而其他方法提得DNA使用相同引物均可實現(xiàn)擴增，說明高鹽低pH法提取的基因組DNA質(zhì)量不高。CTAB法作為提取植物DNA的常用方法對除去其中所含的多糖類雜質(zhì)效果較好，但常規(guī)CTAB法不太適用于含有較多酚類等次生代謝產(chǎn)物的植物組織，因為這類代謝產(chǎn)物用該法不易去除。改良CTAB法，加入的PVP可減少DNA中酚的污染，β-巰基乙醇的使用也阻止酚氧化成醌，使酚的去除更加容易，提升了所提取基因組DNA的質(zhì)量。結(jié)果表明，改良CTAB法的提取效果優(yōu)于常規(guī)CTAB法，后續(xù)還可以通過方法學進一步優(yōu)化改良CTAB的提取效果。從提得樣品基因組DNA的純度來看，改良CTAB法與試劑盒法提取效果相當，但操作簡單，節(jié)省了試驗時間。改良CTAB法提取得到的基因組DNA經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物可用于雙向測序，進而鑒別其基源，可與常見混淆品準確區(qū)分，說明通過分子生藥學方法鑒別畬藥十二時辰的真?zhèn)螠蚀_可行。

可見，本研究建立的改良CTAB法能有效地提取畬藥十二時辰的基因組DNA，方法操作簡單、DNA質(zhì)量較好，并可用于畬藥十二時辰與混淆品的分子生藥學鑒別。