王 標(biāo)， 陳 艷

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率位列癌癥的第2位[1]。目前，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)慢性感染是HCC最主要的危險(xiǎn)因素，占病例總數(shù)的50%以上[2]。晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白質(zhì)、脂肪和核酸與還原糖發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)(Maillard反應(yīng))形成的不可逆的終產(chǎn)物[3]。糖尿病患者體內(nèi)血糖水平高，AGEs病理性增加，從而參與了多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，例如糖尿病腎病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)、高血壓病、阿爾茨海默癥等[4]。由于肝臟是代謝、降解、清除AGEs的重要器官[5]，越來(lái)越多的研究關(guān)注AGEs與HCC之間的聯(lián)系[6-8]。AGEs主要通過(guò)與相應(yīng)的受體(AGE-Rs)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。目前已發(fā)現(xiàn)的AGE-Rs包括AGE受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、低聚糖轉(zhuǎn)移酶-48(OST-48, AGE-R1)、80K-H磷酸蛋白(AGE-R2)、β-半乳糖凝集素-3(galectin-3, AGE-R3)以及清道夫受體B類Ⅰ型(MSR-BI, CD36)和A類Ⅱ型(MSR-AⅡ)等[9]，其中AGEs與RAGE結(jié)合誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧壓力升高，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、血管新生和細(xì)胞增殖等；與AGE-R1、AGE-R2或AGE-R3結(jié)合形成復(fù)合物，負(fù)責(zé)AGEs的脫毒和清除[10]。研究發(fā)現(xiàn)，AGE-Rs具有拮抗AGEs-RAGE的作用[9,11-14]。本研究旨在探討HBV對(duì)AGE-Rs表達(dá)及AGEs誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞增殖的影響，為探討HBV通過(guò)影響AGEs的作用從而促進(jìn)HCC的可能性提供線索，以期進(jìn)一步拓展HBV感染引發(fā)HCC的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和細(xì)胞株 重組質(zhì)粒pRep-1.2HBV為將1.2倍B基因型HBV的基因組克隆于表達(dá)載體pRep10(美國(guó)Invitrogen公司)上所得，其對(duì)照質(zhì)粒pRepSal為表達(dá)載體pRep10去除表達(dá)盒后改造而成[15]；HCC細(xì)胞株HepG2和HepG2.2.15由本實(shí)驗(yàn)室保存，HepG2.2.15 為攜帶有HBV基因組的肝癌細(xì)胞株。

1.1.2主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、抗生素G418和Puromycin(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(德國(guó)PAN公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(美國(guó)Thermo Fisher公司)；TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green?Premix Ex TaqTM試劑和高保真PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(日本TaKaRa公司)；引物(福州鉑尚生物技術(shù)有限公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；anti-AGE-R1抗體和anti-AGE-R3抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；anti-β-actin抗體和兔二抗(美國(guó)Cell Signaling公司)；Western及IP細(xì)胞裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司)；CCK-8檢測(cè)試劑(日本同仁化學(xué)研究所)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HCC細(xì)胞株HepG2和HepG2.2.15用DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)于37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。HepG2.2.15的培養(yǎng)液中需添加抗生素G418(380 μg/mL)。HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞以每孔2.5×106個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h后收獲細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的前1天，HepG2細(xì)胞以每孔6×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于35 mm的6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，20 h后用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，pRepSal、pRep-1.2HBV轉(zhuǎn)染量為每孔3 μg，轉(zhuǎn)染后48 h收獲細(xì)胞。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIzol試劑提取RNA，隨后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit獲取cDNA，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。利用獲得的cDNA和TB Green?Premix Ex TaqTM試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣本每種基因做3個(gè)復(fù)孔，引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for Real-time PCR

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western-blot) 采用Western及IP細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度后進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)，以anti-AGE-R1、anti-AGE-R3和anti-β-actin抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)。掃描蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作圖進(jìn)行分析。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，以含AGEs(100 μg/mL)和葡萄糖(5.6 mmol/L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，連續(xù)檢測(cè)7 d。檢測(cè)時(shí)，去除原培養(yǎng)液，每孔加入90 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液和10 μL CCK-8孵育1 h，在酶標(biāo)儀上以450 nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔光密度(OD)值。將第1天的OD值定為1，以天數(shù)為橫坐標(biāo)繪制增殖曲線。

2 結(jié) 果

2.1HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中AGE-Rs的mRNA表達(dá)水平 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞比較，HepG2.2.15細(xì)胞中AGE-R1和AGE-R3的mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，而AGE-R2的mRNA表達(dá)水平則無(wú)明顯變化(圖1)。

AGE:晚期糖基化終產(chǎn)物。與對(duì)照組比較，△：P<0.05。圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中AGE-Rs mRNA表達(dá)Fig.1 The mRNA expression levels of AGEs-Rs in HepG2 and HepG2.2.15 detected by Real-time PCR

2.2過(guò)表達(dá)1.2 HBV對(duì)AGE-Rs mRNA表達(dá)水平的影響 HepG2細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRep-1.2HBV及其對(duì)照質(zhì)粒pPepSal后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與pRepSal轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染pRep-1.2 HBV的HepG2細(xì)胞中AGE-R1和AGE-R3的mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)，而AGE-R2的mRNA表達(dá)水平則無(wú)明顯變化(圖2)。

2.3HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中AGE-Rs蛋白表達(dá)水平 提取HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞比較，HepG2.2.15細(xì)胞中AGE-R1和AGE-R3的蛋白表達(dá)水平均明顯下降，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

AGE:晚期糖基化終產(chǎn)物。與對(duì)照組比較，△：P<0.05。圖3 Western-blot檢測(cè)HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中AGE-R1和AGE-R3蛋白表達(dá)Fig.3 The protein expression levels of AGEs-R1 and AGE-R3 in HepG2 and HepG2.2.15 detected by Western-blot

2.4過(guò)表達(dá)1.2 HBV對(duì)AGE-Rs蛋白表達(dá)水平的影響 HepG2細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRep-1.2HBV及其對(duì)照質(zhì)粒pRepSal，48 h后提取總蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染1.2倍HBV基因組的細(xì)胞中，AGE-R1 和AGE-R3的蛋白表達(dá)水平均顯著下降，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

AGE:晚期糖基化終產(chǎn)物。與對(duì)照轉(zhuǎn)染組比較，△：P<0.05。圖4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV對(duì)AGE-R1和AGE-R3蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The influence of transient transfection of HBV on protein expression of AGEs-R1 and AGE-R3

2.5HBV促進(jìn)AGEs誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞增殖 為驗(yàn)證HBV是否通過(guò)抑制AGE-R1和AGE-R3表達(dá)促進(jìn)AGEs誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞HepG2增殖，以100 μg/mL的AGEs誘導(dǎo)HCC細(xì)胞HepG2和HepG2.2.15，并采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，從第4天起，在AGEs誘導(dǎo)下，HepG2.2.15細(xì)胞的增殖明顯高于HepG2細(xì)胞，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)，說(shuō)明HBV可促進(jìn)AGEs誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞增殖。

AGE:晚期糖基化終產(chǎn)物。與HepG2 AGEs對(duì)照組比較，△：P<0.05。圖5 HBV對(duì)AGEs誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖的影響Fig.5 The influence of HBV on the proliferation of hepatoma cells induced by AGEs

3 討 論

HBV感染是嚴(yán)重威脅人們健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。全球近30%人口曾感染過(guò)HBV，目前慢性乙肝患者已超過(guò)3.5億人，且每年約有78萬(wàn)人死于HBV相關(guān)性疾病[16]。在慢性乙肝患者中，25%的患者將逐漸發(fā)展為肝纖維化、肝硬化及HCC而危及生命[17]。HBV感染是HCC的關(guān)鍵致病因素，因此，深入研究HBV的致癌機(jī)制，可為HCC的預(yù)防和治療提供有力的理論依據(jù)。

AGEs的形成是一個(gè)緩慢的過(guò)程。最初大分子物質(zhì)的氨基與糖分子的醛基發(fā)生反應(yīng)，形成可逆的Schiff堿，隨后Schiff堿經(jīng)過(guò)一系列分子重排形成酮氨類化合物，再進(jìn)一步脫水和凝聚，最終形成不可逆的終產(chǎn)物[18]。AGEs包括外源性和內(nèi)源性2種。外源性AGEs主要從外界攝入，包括吸煙或進(jìn)食某些食物；內(nèi)源性AGEs主要由機(jī)體自身合成，在正常個(gè)體中，內(nèi)源性AGEs會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)緩慢形成，而高血糖則大大加快這一過(guò)程，因此，糖尿病患者體內(nèi)AGEs含量較正常人群顯著增高。AGEs含量增多是糖尿病患者的重要病理特征，是多種糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵致病因子。肝臟是代謝和清除AGEs的重要器官，AGEs可作用于肝臟引發(fā)各種肝臟疾病，包括HCC、非酒精性脂肪性肝病和肝硬化[5]。Chen等[6-7]的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs通過(guò)誘導(dǎo)ROS增高，促進(jìn)碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element binding protein, ChREBP)的表達(dá)和HCC細(xì)胞的增殖。Takino等[8]指出，AGEs可提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，增強(qiáng)HCC細(xì)胞血管新生的能力。Sato等[19]給大鼠口服AGEs含量較高的飲料，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟中AGEs富集并誘導(dǎo)肝細(xì)胞VEGF表達(dá)，提示食源性的AGEs可能具有致HCC的作用。由此可見(jiàn)，AGEs是糖尿病患者HCC患病率高的一個(gè)重要因素。

AGEs的致病作用主要由其受體RAGE介導(dǎo)，AGEs-RAGE可激活胞內(nèi)多條信號(hào)通路，例如NF-κB，MAPK，JAK-STAT及PI3K信號(hào)通路，誘導(dǎo)ROS上升，導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞增殖、血管新生等[20]。除了RAGE之外，AGEs還可與AGE-Rs結(jié)合。與RAGE不同的是，AGE-Rs發(fā)揮著降解、清除AGEs的作用。AGE-R1和AGE-R3與AGEs具有較高的親和力，而AGE-R2無(wú)法直接與AGEs結(jié)合，需與AGE-R1以及AGE-R3形成復(fù)合物后發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，AGE-R1可加速AGEs的清除，抑制RAGE信號(hào)通路，從而降低ROS和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[3]。AGE-R3可干擾RAGE通路，對(duì)AGEs誘導(dǎo)的組織損傷發(fā)揮保護(hù)作用[13]。提示任何引起AGE-Rs表達(dá)改變的因素，均可能影響AGEs-RAGE信號(hào)通路的致病作用。

本研究關(guān)注了HBV對(duì)AGE-Rs表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)HBV可抑制AGE-R1和AGE-R3的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，但并不影響AGE-R2的表達(dá)，提示HBV可能會(huì)抑制肝臟對(duì)AGEs的清除，造成AGEs累積，從而增強(qiáng)AGEs-RAGE信號(hào)通路，促進(jìn)HCC的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖，而本研究利用CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HBV會(huì)促進(jìn)AGEs作用下的HCC細(xì)胞增殖，進(jìn)一步說(shuō)明HBV通過(guò)抑制AGE-R1和AGE-R3的表達(dá)來(lái)促進(jìn)AGEs誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞增殖。

大量流行病學(xué)證據(jù)指出，糖尿病可提高HCC的患病風(fēng)險(xiǎn)，使用治療糖尿病的藥物二甲雙胍可以降低HCC的發(fā)病率[21-25]?？梢?jiàn)，糖尿病也是HCC發(fā)生的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Tan等[26]的一項(xiàng)系統(tǒng)性回顧和薈萃分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病可提高乙肝患者HCC的發(fā)生率，這意味著乙肝合并糖尿病將大大提高HCC的發(fā)病率。然而，HBV與糖尿病之間是否存在相互影響進(jìn)而促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV可通過(guò)抑制AGE-R1和AGE-R3的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)AGEs誘導(dǎo)下HCC細(xì)胞的增殖。由于AGEs是糖尿病患者HCC高發(fā)的重要致病因素，因此這一結(jié)果不僅豐富了HBV的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為進(jìn)一步探討HBV與糖尿病的共同致癌機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。然而，HBV如何影響AGE-Rs表達(dá)，下游哪些信號(hào)通路受到影響仍不清楚，目前相關(guān)研究仍在進(jìn)行中。