陳 壹， 巫曉強， 林慶明， 侯建明

骨質(zhì)疏松是一種因骨吸收和骨形成解耦連，出現(xiàn)骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞的全身代謝性骨病。 絕經(jīng)后婦女因雌激素水平下降，破骨細(xì)胞的活性明顯高于成骨細(xì)胞，逐漸出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。雌二醇或二磷酸鹽的替代療法可使因絕經(jīng)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松患者的骨量增加，但這些藥物存在增加婦科惡性腫瘤概率等副作用。乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是一種由上皮細(xì)胞及外分泌腺分泌、相對分子質(zhì)量為80 kDa的鐵結(jié)合糖蛋白，不僅具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功能，還能通過抑制破骨細(xì)胞形成，促進成骨細(xì)胞增殖、分化而增加骨量[1]。但LF通過何種分子機制促進骨形成值得探究。胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是一種能夠促進骨組織代謝及生長的細(xì)胞因子[2]，同時，IGFBPs (insulin-like growth factor binding proteins)可以通過阻止或易化IGF-Ⅰ與目標(biāo)細(xì)胞表面IGF-Ⅰ受體(insulin-like growth factor-I receptor，IGF-ⅠR)的結(jié)合而影響骨形成[3]。體外研究表明，LF不僅促進IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR mRNA的表達[4]，還可通過促IGF-Ⅰ mRNA的表達阻止原代成骨細(xì)胞凋亡[5]。本研究擬探討口服LF 6個月后對去卵巢大鼠骨量及骨組織中IGF-Ⅰ、IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 70只6個月齡健康雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體質(zhì)量(250±20) g [福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物批號：SCXK(閩)2012-0001]。

1.1.2主要試劑 97% LF(批號：BN002865，產(chǎn)于新西蘭，南京天淳公司)；牛血清白蛋白(美國Sigma公司)；苯甲酸雌二醇(杭州動物制藥廠)；TRIzol RNA 提取試劑盒(美國 Invitrogen 公司)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本 TaKaRa 公司)；DEPC水(美國 Biosharp 公司)。

1.2方法

1.2.1建模和分組 SD大鼠在室溫(20±3)℃、相對濕度為40%～60%的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂以經(jīng)高壓處理的普通飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，隨機分為 7 組：假手術(shù)組和去卵巢模型及其干預(yù)組 6 組，每亞組 10 只。所有大鼠均予腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g，假手術(shù)組僅切除卵巢附近與之等質(zhì)量的脂肪組織；干預(yù)組作背部脊柱兩側(cè)切口，摘除雙側(cè)卵巢。術(shù)后1周依不同干預(yù)措施分組:

1.2.1.1骨質(zhì)疏松模型組(Con組) 2 mL蒸餾水每天灌胃1次。

1.2.1.2假手術(shù)組(Sham組) 2 mL蒸餾水每天灌胃1次。

1.2.1.3骨質(zhì)疏松模型雌激素干預(yù)組(E2組) 苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg每周肌內(nèi)注射1次。

1.2.1.4骨質(zhì)疏松模型牛血清白蛋白組(bovine serum albumin，BSA組) 將100 mg/kg的BSA溶解于2 mL蒸餾水，每天灌胃1次。

1.2.1.5不同劑量的骨質(zhì)疏松模型LF1～LF3組 分別將100，1 000，2 000 mg/kg的LF溶解于2 mL蒸餾水，每天灌胃1次。

每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整藥品用量，每千克體質(zhì)量藥量濃度不變。持續(xù)稱量6個月。

1.2.2標(biāo)本采集與脫鈣 干預(yù) 6個月后處死動物，分離大鼠的股骨和脛骨。收集各組大鼠的右側(cè)股骨，-80 ℃冷凍。將左側(cè)脛骨置于4%多聚甲醛中，24 h 后放入10%EDTA脫鈣液中，根據(jù)脫鈣程度置換脫鈣液直至脫鈣終點。切取干骺端的骨組織。

1.2.3蘇木精-伊紅(H-E)染色及圖像分析 將脫鈣后的骨組織用不同濃度的乙醇脫水，再用二甲苯作透明處理，石蠟包埋。將蠟塊固定在切片機上，截取距脛骨骺線約 0.2 mm位置干骺端的薄片，厚度 5～8 μm。切片脫蠟、水合，經(jīng)H-E染色后，光學(xué)顯微鏡下拍攝截面圖。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算骨小梁平均面積所占骨髓腔比例(比值)。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR，RT-PCR) 采用TRIzol試劑分離股骨近端骨組織總RNA。檢測該樣品在波長260和280 nm處的OD值(ND-1000紫外分光光度計，OD比1.8～2.0)，計算骨組織RNA的濃度。再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將 5 mg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)(96孔板，反應(yīng)體系25 μL)，其中包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、cDNA及目標(biāo)基因引物(引物序列見表1)。在Thermal Cycler DiceTMReal Time系統(tǒng)中行RT-PCR檢測。所有反應(yīng)重復(fù)3次，β-actin作為內(nèi)參，設(shè)定正常對照組目的基因mRNA相對表達量為1，應(yīng)用2-△△Ct法計算：

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 The primer sequences for quantitative real-time PCR

(1)△Ct對照樣品=目的基因(meanCt)-管家基因(meanCt)

△Ct待測樣品=目的基因(meanCt)-管家基因(meanCt)

(2)對照樣品及待測樣品的歸一列式：

△△Ct=△Ct待測樣品—△Ct對照樣品均值

(3)mRNA表達相對量=2-△△Ct

2 結(jié) 果

2.1體質(zhì)量比較 干預(yù)前各組體質(zhì)量比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05，表2)。干預(yù)結(jié)束后，除Sham和E2組外，其他組的大鼠體質(zhì)量均明顯增加，其中Con組較Sham組和E2組顯著增加(均P<0.01)。BSA和LF1～LF3組的體質(zhì)量均低于Con組，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05，表2)。在雌激素的作用下，E2組未出現(xiàn)因切除卵巢引起的體質(zhì)量增加。

表2 干預(yù) 6個月前后各組體質(zhì)量變化Tab.2 The body weights among the seven groups before and after 6 months of treatment

2.2骨組織H-E染色病理切片及圖像分析 E2和Sham組的骨小梁密度較其他各組致密；Con組和BSA組不如LF1～LF3組致密。同時，肉眼無法分辨LF1～LF3組間的骨小梁密度差別(圖1)。Image-Pro Plus 6.0分析數(shù)據(jù)表明，E2和Sham組的比值顯著高于Con、BSA及LF1～LF3組(均P<0.01，圖2)。與LF1～LF3組比較，Con和BSA組的比值明顯降低(均P<0.01，圖2)。Sham與E2組、Con與BSA組、LF1～LF3組各組間比值比較，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

LF:乳鐵蛋白。A：Con 模型組；B：Sham 假手術(shù)組；C：E2 雌激素組；D：牛血清白蛋白100 mg/(kg·d)組；E～G：LF 100， 1 000， 2 000 mg/(kg·d)組。圖1 脛骨干骺端病理組織切片(H-E染色 ×40)Fig.1 Hematoxylin and eosin-stained section of metaphysis under the tibia(H-E ×40)

表中數(shù)據(jù)為模型組；Sham：假手術(shù)組；E2：雌激素組；BSA：牛血清白蛋白100 mg/(kg·d)；LF1：乳鐵蛋白100 mg/(kg·d)；LF2：乳鐵蛋白1 000 mg/(kg·d)；LF3：乳鐵蛋白2 000 mg/(kg·d)；與Con組比較，●：P<0.01；與Sham組比較，△：P<0.01。圖2 干預(yù)6個月后各組骨小梁平均面積所占骨髓腔比例Fig.2 The area ratio of trabecular area by marrow cavity

2.3股骨IGF-Ⅰ、IGFBP-3和IGFBP-5 mRNA的表達情況 干預(yù) 6個月后，Sham、E2、LF1～LF3組中的IGF-Ⅰ mRNA水平較Con組明顯升高(均P<0.01，圖3A)。與E2和Sham組比較，Con組的IGFBP-3 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01，圖3B)，而LF1～LF3組中IGFBP-3 mRNA水平均明顯低于Con組(均P<0.01，圖3B)。此外，E2和Sham組的IGFBP-5 mRNA水平顯著升高(均P<0.01，圖3C)。雖然不同LF組的IGFBP-5 mRNA水平均高于Con組，但僅LF2～LF3組的IGFBP-5 mRNA水平升高有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05和P<0.01，圖3C)。

表中數(shù)據(jù)為胰島素樣生長因子;IGFBP：胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白。Con：模型組；Sham：假手術(shù)組；E2：雌激素組；BSA：牛血清白蛋白100 mg/(kg·d)；LF1：乳鐵蛋白100 mg/(kg·d)；LF2：乳鐵蛋白1 000 mg/(kg·d)；LF3：乳鐵蛋白2 000 mg/(kg·d)。A:IGF-Ⅰ mRNA; B:IGFBP-3 mRNA; C:IGFBP-5 mRNA。與Con組比較，●：P<0.01，△：P<0.05。圖3 干預(yù)6個月后各組IGF-Ⅰ, IGFBP-3及IGFBP-5 mRNA相對表達量Fig.3 The local expression of IGF-Ⅰ, IGFBP-3 and IGFBP-5 mRNA after 6 months of treatment

3 討 論

骨質(zhì)疏松是以骨吸收大于骨形成而出現(xiàn)骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞的慢性全身代謝性骨病。研究表明，LF可通過抑制骨吸收，促進骨形成而減少骨丟失[4]。本研究使用不同劑量的LF干預(yù)去卵巢后骨質(zhì)疏松模型大鼠，觀察其對骨量變化的影響及其可能的分子生物學(xué)機制。

LF在體外能夠刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，8.5和85.0 mg/kg濃度的干預(yù)條件下，LF可增加骨的機械強度和骨密度[6]。有研究表明，口服LF促骨形成作用是通過調(diào)整骨微結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)[7]。與對照組比較，LF干預(yù)組的骨小梁數(shù)目增多，腰椎和股骨的骨體積增大，骨小梁厚度增加，骨密度增高。LF濃度為1 000和2 000 mg/(kg·d)條件下，骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度顯著增加。Cheng等[8]發(fā)現(xiàn)，LF可以通過刺激成骨細(xì)胞增殖而增加骨量，卻對破骨細(xì)胞活性無明顯影響，即該作用并非通過抑制骨吸收而實現(xiàn)。本研究在光鏡下觀察脛骨干骺端橫截面發(fā)現(xiàn)，LF1～LF3組骨小梁密度較Con組致密，但不如E2組和Sham組顯著。采用Image-Pro Plus 6.0分析各組骨小梁面積占骨髓腔比例可見，E2、Sham和LF1～LF3組的比值均顯著高于Con組，但LF1～LF3組均不及Sham組和E2組明顯，推測LF增加骨量的作用雖不如雌激素明顯，但也可在一定程度上抑制骨吸收、促進骨形成。

IGF系統(tǒng)包括IGFs (IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)、IGFs受體和IGFBPs。Cornish等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ是保持骨骼穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的細(xì)胞因子，它可通過與成骨細(xì)胞的IGF-ⅠR結(jié)合，從而激活p42/44 MAPK和PI3K介導(dǎo)的信號通路，最終促進成骨細(xì)胞的增殖和分化。有研究表明，口服LF對骨吸收標(biāo)志物的抑制作用可能通過上調(diào)IGF-Ⅰ mRNA實現(xiàn)，減少因去卵巢引起的骨量丟失[4]。體外實驗中，LF可通過IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR通路刺激成骨細(xì)胞增殖及骨形成；同時，LF可通過上調(diào)IGF-Ⅰ的表達發(fā)揮抑制成骨細(xì)胞凋亡的作用[4-5]。在以老年骨質(zhì)疏松模型(SAMP6小鼠)和衰老成骨細(xì)胞為對象的研究中，LF可促進堿性磷酸酶、IGF-Ⅰ等成骨細(xì)胞標(biāo)志物表達而促進成骨細(xì)胞增殖，并通過降低p16和p21延緩衰老，起到抗氧化應(yīng)激作用[10]。

本研究中，與Con組比較，LF1～LF3組IGF-Ⅰ mRNA的表達顯著升高。Sjogren等[11]發(fā)現(xiàn)，由肝臟分泌的IGF-Ⅰ減少導(dǎo)致的骨量損失非常小，而循環(huán)中的IGF-Ⅰ水平降低導(dǎo)致的骨量減少所占比例卻高達75%。Gao等[12]發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用LF可促進大鼠顱骨缺損模型的骨再生。Govoni[13]選擇性基因敲除小鼠目標(biāo)組織周圍IGF-Ⅰ，使其表達量降低而導(dǎo)致骨量下降。在該研究中，骨組織和肝臟組織周圍IGF-Ⅰ減少均可出現(xiàn)骨密度和骨小梁體積下降，前者較后者更為明顯。而Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)，過表達IGF-Ⅰ在不改變成骨細(xì)胞數(shù)量的情況下可增加松質(zhì)骨量。以上研究均表明，循環(huán)或骨組織周圍IGF-Ⅰ的增加導(dǎo)致促骨形成，較其他組織釋放過多的IGF-Ⅰ促骨形成作用更為明顯。

不論在細(xì)胞培養(yǎng)液中還是在體內(nèi)，IGFs都結(jié)合其調(diào)節(jié)蛋白并以無活性的復(fù)合物形式存在。目前已發(fā)現(xiàn)6種IGFBP(IGFBP-1，IGFBP-2，IGFBP-3，IGFBP-4，IGFBP-5，IGFBP-6)。IGFBP-1，IGFBP-2，IGFBP-4及IGFBP-6通過與IGF結(jié)合形成具有抑制作用的二級復(fù)合物(IGFs-IGFBPs)，該復(fù)合物能夠穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞，并能被特定的蛋白酶水解，最終在循環(huán)中更容易被降解；而IGFBP-3和IGFBP-5主要通過與IGF-Ⅰ形成三級復(fù)合體而發(fā)揮作用。因此，復(fù)合體難以通過血管內(nèi)皮細(xì)胞而聚集在組織周圍。此時，IGFBP-5或IGFBP-3通過與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合而降低與IGF的親和力，從而使IGF受體附近IGF的局部濃度增加[6]。IGFBP-3和IGFBP-5也具有獨立于IGFs的作用：IGFBP-5可通過與細(xì)胞核或細(xì)胞膜表面IGFBP-5特異性受體結(jié)合而獨立于IGF-Ⅰ發(fā)揮促進骨形成作用，這種現(xiàn)象并非需要通過增加血清IGF-Ⅰ水平而實現(xiàn)[15]。在體外實驗中，IGFBP-5是唯一一種可持續(xù)刺激成骨細(xì)胞增殖的IGF結(jié)合蛋白[16]。本研究中，雖然不同LF組的IGFBP-5 mRNA水平均高于Con組，但這些升高僅在LF2～LF3組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)，提示LF可能通過促進IGFBP-5 mRNA表達而增加骨量。與E2組和Sham組比較，Con組的IGFBP-3 mRNA水平顯著降低(P<0.01)，而LF1～LF3組中IGFBP-3 mRNA表達水平更低(P<0.01)。Silha等[17]的研究提示，過表達IGFBP-3可增加破骨細(xì)胞的數(shù)量而促進骨吸收、抑制骨形成。Baumrucker等[18]的研究表明，在細(xì)胞外的LF可使IGFs與IGFBP-3的結(jié)合解離，并與IGF-Ⅱ競爭性地結(jié)合IGFBP-3，而不結(jié)合IGFBP-5。這也許能解釋在LF干預(yù)后IGFBP-3 mRNA表達下調(diào)的原因，并提示LF增加骨量的作用可能是通過抑制IGFBP-3 mRNA表達水平而實現(xiàn)。

雌激素可通過影響體內(nèi)的某些激素水平和進食量來控制體質(zhì)量，并增加脂肪中瘦素的表達而抑制脂肪細(xì)胞的形成[19]。本研究中，E2及Sham組體質(zhì)量的增量遠(yuǎn)小于其他組，說明雌激素可控制因去卵巢所致的體質(zhì)量增加。雌激素作為防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的藥物已應(yīng)用于臨床多年。雖然LF能增加骨組織IGF-Ⅰ mRNA的表達，并可能減少因長期使用雌激素而出現(xiàn)的副作用，卻無法控制大鼠去卵巢后體質(zhì)量的增加。

綜上所述，LF可在一定程度減少去卵巢大鼠骨丟失，促進股骨IGF-Ⅰ和IGFBP-5 mRNA的表達，抑制IGFBP-3 mRNA的表達，這也許能作為LF治療骨質(zhì)疏松的一個重要因素。如果能進一步研究在LF干預(yù)下IGF-Ⅰ、IGFBP-3和IGFBP-5調(diào)控骨量的下游信號通路之間的關(guān)系，將給臨床提供更多治療骨質(zhì)疏松的思路。