毛 騫,陳翠翠,梁煥坤,劉鵬娥,鐘樹海,李來慶

（1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 吉林132001；2.廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司，廣東 廣州510663）

近年來，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命安全［1］。骨質(zhì)疏松癥早期常不能引起人們的注意和重視，就診時(shí)病情嚴(yán)重甚至已發(fā)生骨折。目前主要采用雙能X線吸收儀（dual energy X-ray absorptiometry，DXA）測(cè)定骨密度來診斷骨質(zhì)疏松癥，但存在價(jià)格昂貴、操作繁瑣和普及率低等不足，在基層難以推廣應(yīng)用［2-3］。因此，早期快速、準(zhǔn)確、敏感和定量診斷對(duì)預(yù)防和監(jiān)測(cè)骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。β膠聯(lián)降解產(chǎn)物又稱Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列（β-cross-linked C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen，β-CTX），是骨重建過程中膠原被降解后釋放入血的片段，β-CTX水平的升高反映了骨吸收程度、骨質(zhì)流失增加，以致骨質(zhì)疏松癥和變形性骨病的發(fā)生。β-CTX與骨轉(zhuǎn)換或骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density，BMD）等標(biāo)志物之間存在相關(guān)性，是診斷骨轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物［4-5］。骨鈣素可直接反映骨形成的狀況，但血液標(biāo)本放在室溫下1 h后，骨鈣素即會(huì)大量降解，其降解產(chǎn)物骨鈣素N端中分子片段 （N-terminal middle molecular fragment of osteocalein，N-MID）因其具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可代替骨鈣素反映骨形成狀態(tài)［6］。因此，N-MID常應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的臨床療效觀察和預(yù)后判斷［7-8］。本研究在國內(nèi)首次建立了β-CTX和N-MID水平雙標(biāo)記的時(shí)間分辨免疫熒光分析（double-labeled time-resolved immunofluorescence analysis，TRFIA）法，以ELISA檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，為快速、精準(zhǔn)篩查或監(jiān)測(cè)骨質(zhì)疏松癥提供了新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 抗體、試劑和儀器

抗β-CTX和N-MID單克隆抗體（MAb）4E5和2B7（包被抗體）、2G6和5A 3（檢測(cè)抗體）和β-CTX和N-MID標(biāo)準(zhǔn)抗原均由廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司制備，銪離子（Eu3+）和釤離子（Sm3+）標(biāo)記試劑盒（美國PerkinElmer公司），牛血清白蛋白（美國Fitzgerald公司），Sephades-G50填料（美國GE公司），96孔培養(yǎng)板（美國Costar公司），包被緩沖液、洗滌液、封閉液和增強(qiáng)液均為自制。Victor 1420全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)儀（美國PerkinElmer公司）。

1.2 固相包被抗體的制備和檢測(cè)抗體的標(biāo)記

將構(gòu)建好的包被抗體采用緩沖液稀釋至10 mg·L－1，按每孔100μL加入96孔微孔板中包被，4℃過夜，棄去包被液，加入封閉液，每孔250μL，37℃封閉2 h，棄掉封閉液，洗滌液洗滌2次，真空冷凍抽干，于－20℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書，采用Eu3+和Sm3+標(biāo)記試劑盒進(jìn)行抗體標(biāo)記。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

采用Tris-HCl緩沖液（pH 7.8），將β-CTX抗原配制成濃度為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5和5.0μg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將N-MID抗原配制成濃度為0、10、20、80、160和200μg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4 TRFIA方法檢測(cè)性能評(píng)估

1.4.1 靈敏度和特異度檢測(cè) 采用“1.3”步驟中制備的β-CTX系列標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以0μg·L－1β-CTX標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，將其測(cè)定的20次熒光值均值（mean）加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差（2SD）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算TRFIA方法的靈敏度。采用“1.3”步驟中制備的N-MID系列標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制方法同β-CTX標(biāo)準(zhǔn)品。

特異度檢測(cè)：同時(shí)檢測(cè)β-CTX標(biāo)準(zhǔn)品、N-MID標(biāo)準(zhǔn)品、Ⅰ型膠原蛋白氨基末端肽（N-terminal peptide of collagen typeⅠ，NTX）、抗酒石酸酸性磷 酸 酶 （tartrate resisitant acid phosphatase，TRACP）、生長激素（growth hormone，GH）、骨特異性堿性磷酸酶（bonespecific alkalinephosphatase，BACP）、骨保護(hù)蛋白（osteoprotegerin，OPG）和甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）水平。

1.4.2 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)濃度已知的3個(gè)β-CTX和N-MID標(biāo)準(zhǔn)品分別按1∶2、1∶4和1∶8濃度倍比稀釋，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，比較樣本的測(cè)定值、真值并計(jì)算其比值（稀釋回收率）。

將β-CTX和N-MID標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至高、中和低3個(gè)濃度，每個(gè)濃度各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)檢測(cè)10次，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 采用本研究制備的TRFIA試劑盒置于4℃冰箱6個(gè)月和37℃、7 d，對(duì)試劑盒的物理外觀，劑量-反應(yīng)曲線的線性、靈敏度、準(zhǔn)確度和特異度等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，具體檢測(cè)方法同“1.4.1”和“1.4.2”步驟。

1.5 臨床樣本對(duì)比檢測(cè)

收集2018年3月—2019年3月北華大學(xué)附屬醫(yī)院X射線骨密度儀確診的骨質(zhì)疏松癥患者晨起空腹血清和對(duì)應(yīng)健康成人的晨起空腹血清。骨質(zhì)疏松癥患者分為青少年組（15例）、妊娠期婦女組（22例）、絕經(jīng)期婦女組（26例）和老年人組（31例），陰性樣本為對(duì)應(yīng)年齡段的非骨質(zhì)疏松的健康者。β-CTX和N-MID分別采用TRFIA法、化學(xué)發(fā)光法和ELISA法進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，分析評(píng)價(jià)其對(duì)骨質(zhì)疏松癥的檢測(cè)效果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。平行測(cè)定10次0μg·L－1參考標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靈敏度，采用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，采用Origin 8軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 TRFIA的最佳反應(yīng)條件

經(jīng)過優(yōu)化，最終確定TRFIA最佳的反應(yīng)條件：β-CTX和N-MID包被抗體的濃度為10 mg·L－1，每孔100μL和8 mg·L－1，每孔100μL；Eu3+標(biāo)記試劑：標(biāo)記抗體最佳比例為70μL∶30μL；Sm3+標(biāo)記試劑：標(biāo)記抗體最佳比例為75μL∶25μL；反應(yīng)體系為25μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品+200μL分析緩沖液+每孔200μL Eu3+（或Sm3+）-檢測(cè)抗體+每孔200μL增強(qiáng)液。

2.2 靈敏度和特異度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

β-CTX方程：Y=0.998 8X+0.857 6，R2=0.999 4，線性范圍 為0.025～5.000μg·L－1；N-MID方程：Y=0.033 0X+0.621 1，R2=0.999 4，線性范圍為0.5～200.0μg·L－1。平行測(cè)定10次0μg·L－1參考標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值，并計(jì)算其均值（mean）及標(biāo)準(zhǔn)差（SD），采用mean+2SD代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出TRFIA法對(duì)β-CTX的檢測(cè)靈敏度為0.025μg·L－1，TRFIA法對(duì)N-MID的 檢 測(cè) 靈 敏 度 為0.5μg·L－1。同 步 檢 測(cè)NTX、TRACP、GH、BALP、OPG和PTH均為陰性，無明顯交叉反應(yīng)表明該試劑盒特異性良好。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

β-CTX的3個(gè)樣品3個(gè)水平稀釋度的稀釋回收率為98.6%～104.6%，N-MID的3個(gè)樣品3個(gè)水平稀釋度的稀釋回收率為98.9%～105.6%（表1），稀釋倍數(shù)與濃度呈線性關(guān)系。批內(nèi)變異系數(shù)（CV）為5.81%～7.82%，β-CTX批間CV為5.97%～8.02%；N-MID批內(nèi)CV為6.05%～8.32%，批間CV為6.14%～8.56%（表2）。批內(nèi)和批間CV均小于10%，符合臨床檢測(cè)試劑盒要求。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試劑盒置于4℃冰箱能穩(wěn)定保存6個(gè)月以上，37℃熱破壞性試驗(yàn)?zāi)芊€(wěn)定保存7 d以上，說明該TRFIA方法制備的試劑盒穩(wěn)定性較好。見表3。

2.5 臨床樣本的對(duì)比檢測(cè)結(jié)果

將制備的雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒與CLIA和ELISA法同時(shí)檢測(cè)94例骨質(zhì)疏松癥患者和94例非骨質(zhì)疏松癥健康者的血清，TRFIA法與CLIA和ELISA法檢測(cè)結(jié)果一致，3種檢測(cè)方法的符合率為100%（表4），表明本研究建立的TRFIA方法可快速、準(zhǔn)確和定量地檢測(cè)β-CTX和N-MID臨床樣本。

圖1 TRFIA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of TRFIA Kit

表1 TRFIA試劑盒的稀釋回收率Tab.1 Dilution recovery rates of TRFIA Kit

3 討 論

TRFIA是一種理想的免疫測(cè)定方法，已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如臨床研究、分子生物學(xué)、藥物分析和病毒的檢測(cè)［9-12］。采用鑭系元素螯合物時(shí)，由于發(fā)射波長和動(dòng)力學(xué)不同，非特異性背景和特異性信號(hào)的時(shí)間分辨熒光有區(qū)別，因而能夠采用Eu3+和Sm3+螯合物開發(fā)雙標(biāo)簽TRFIA，從而可以同時(shí)檢測(cè)2種分子［13-15］。

骨質(zhì)疏松相關(guān)的骨折風(fēng)險(xiǎn)通常通過BMD評(píng)估，但是由于骨強(qiáng)度也由其他因素決定，如骨幾何形狀、微結(jié)構(gòu)和大小，因此BMD本身并不是骨折風(fēng)險(xiǎn)的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)［16-17］。目前，骨轉(zhuǎn)換的生化標(biāo)志物正被用于預(yù)測(cè)骨質(zhì)流失的速度和評(píng)估老年人骨折的風(fēng)險(xiǎn)?？梢酝ㄟ^確定代表骨重塑過程的某些蛋白質(zhì)的血清或尿液濃度來估計(jì)骨轉(zhuǎn)換率［18］。這些蛋白質(zhì)可以分為骨形成標(biāo)記和骨吸收標(biāo)記，最具特異性和最敏感的骨形成標(biāo)記物包括β-CTX和N-MID［19-21］。

表2 TRFIA試劑盒檢測(cè)的精密度T ab.2 Precision of T RFIA Kit detection

表3 TRFIA試劑盒檢測(cè)的穩(wěn)定性Tab.3 Stabilities of TRFIA Kit detection

本研究擬采用Eu3+標(biāo)記抗β-CTX單克隆抗體和Sm3+標(biāo)記抗N-MID單克隆抗體，采用雙抗體夾心法建立β-CTX/N-MID雙標(biāo)記TRFIA試劑，自行研制能同時(shí)檢測(cè)人血液β-CTX和N-MID的TRFIA試劑盒，本研究所研制的試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示：β-CTX的檢測(cè)靈敏度為0.025μg·L－1、N-MID的檢測(cè)靈敏度為0.5μg·L－1，定量線性范圍β-CTX在0.05～5.00μg·L－1、N-MID的線性范圍為0.5～200.0μg·L－1，檢測(cè)范圍寬。β-CTX平均稀釋回收率為102.13%，N-MID平均稀釋回收率為103.02%，與其他常見骨檢測(cè)指標(biāo)無明顯交叉反應(yīng)，特異性較強(qiáng)；β-CTX批內(nèi)CV為5.81%～7.82%，批間CV為5.97%～8.02%；N-MID批內(nèi)CV為6.05%～8.32%，批間CV為6.14%～8.56%，達(dá)到臨床測(cè)試要求（批內(nèi)CV＜10%，批間CV＜15%）。此外，雙標(biāo)記試劑盒可在4℃穩(wěn)定保存6個(gè)月，37℃穩(wěn)定保存7 d，這使該雙標(biāo)記TRFIA成為本方法的良好替代品。

表4 TRFIA試劑盒、CLIA和ELISA法對(duì)臨床樣本的對(duì)比檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Comparison test results of clinical samples detected by TRFIA Kit,CLIA,and ELISA methods

本項(xiàng)目研發(fā)的檢測(cè)試劑盒可同時(shí)檢測(cè)單個(gè)樣本中的β-CTX和N-MID水平，集中了TRFIA敏感、定量、簡便和快速的優(yōu)勢(shì)，更適于廣泛推廣，特別適合于基層無法開展儀器檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室。本試劑盒的應(yīng)用將有利于推動(dòng)檢測(cè)基層和城鎮(zhèn)血清樣品中β-CTX和N-MID水平的檢測(cè)，使該檢測(cè)項(xiàng)目成為一個(gè)常規(guī)的普查項(xiàng)目或者家庭式的自檢項(xiàng)目，從而更有效地預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。