于佳慶,方一晽,方銘慧,安培培,胡 正

（吉林大學第一醫(yī)院器官再造與移植教育部重點實驗室，吉林 長春130061）

異種移植是指將一個物種的器官移植到另一物種體內(nèi)，最早關于異種移植的報道［1］是1667年羊血輸入人體的相關研究。異種腎臟移植始于1905年法國研究者［2］將兔腎移植給1例腎衰竭兒童。在1920—1990年關于非人靈長類動物（nonhuman primate，NHP）的腎臟和心臟移植研究中，研究者［3］發(fā)現(xiàn)：非人靈長類動物在倫理學、跨物種微生物感染和器官大小等方面均存在問題，難以作為異種器官移植的理想供體；而豬的器官大小、代謝過程及生理特點等方面與人類相近，并且易于繁育和開展基因編輯，已被公認為理想的異種器官供體來源。目前基因編輯豬已被廣泛應用于異種移植研究領域。NHP是開展異種腎臟移植研究和評估其臨床轉化安全性和有效性的最為理想的動物模型［4］，現(xiàn)階段基于豬腎到NHP的異種移植研究在克服免疫排斥反應、延長移植物存活時間和增強移植器官生理兼容性等方面取得了一系列進展，展現(xiàn)出良好的臨床應用前景。目前異種移植相關的報道均以介紹異種移植整體的研究進展為主，關于豬異種腎臟移植排斥反應和功能障礙的進展報道較少。本研究從異種腎移植面臨的免疫排斥、凝血/生理兼容性問題和跨種屬感染風險等挑戰(zhàn)及制備基因編輯豬推動異種腎移植發(fā)展的貢獻方面進行總結，并展望異種腎移植未來的發(fā)展趨勢。

1 豬異種腎臟移植臨床應用的意義

迄今為止公認的治療終末期腎病的最理想方法是進行腎臟移植，但腎臟供需關系之間的嚴重失衡已成為限制腎移植應用的主要瓶頸問題。根據(jù)美國衛(wèi)生與公共服務部［5］的統(tǒng)計數(shù)據(jù)：截至2020年9月，有99 522例腎病患者在等候腎源，而腎臟捐獻者只有12 652人。據(jù)估計［6］，我國每年約有150萬人需要接受器官移植治療，但器官捐獻人數(shù)僅有約10 000人。異種豬腎臟移植具有許多優(yōu)勢：豬的器官大小、生理和生化指標與人十分接近；豬繁殖效率高，可大量提供異種供體器官；豬細胞的基因編輯的克隆技術成熟，有助于較為快速制備多基因編輯動物；此外，相對于NHP器官移植，豬腎移植的倫理學問題較少，且跨種屬微生物感染風險較?。?］。因此，豬腎異種移植被被寄予厚望。然而，由于豬與人的遺傳背景差異較大，異種移植后易引起強烈的排斥反應［3］，其臨床應用仍需要克服諸多障礙。

2 豬異種腎臟移植臨床應用的主要障礙

豬到NHP腎移植的研究成果已發(fā)展至臨床應用階段，需要克服諸多困難。異種供受體之間的免疫排斥反應、凝血調(diào)節(jié)功能紊亂和豬與靈長類動物器官之間的生理兼容性問題均會對豬腎臟的存活狀態(tài)與生理功能造成影響，最終導致移植失敗。

2.1 異種移植免疫排斥反應

異種免疫排斥反應是異種腎移植需要解決的首要問題，主要分為超急性免疫排斥反應（hyperacute rejection，HAR）、急性體液異種排斥反 應（acute humoral xenograft rejection，AHXR）和T細胞介導的移植排斥，上述反應會對移植物造成不同程度的損傷，最終導致宿主死亡。

2.1.1 HAR HAR是由供體豬內(nèi)皮細胞上的α1，3Gal（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc）表位與受體體內(nèi)的天然異種反應抗體相結合而引起，天然抗體使補體活化，從而在幾小時內(nèi)引起大量出血和血栓形成。α1，3Gal在微生物與大多數(shù)低等哺乳動物體內(nèi)表達，但在人類以及靈長類哺乳動物中不表達，因此人類與靈長類哺乳動物體內(nèi)含有能與α1，3Gal特異性結合的天然異種反應性抗體。去除供體表達的α1，3Gal抗原與受體體內(nèi)的α1，3Gal特異性抗體可以有效緩解HAR［8］。

2.1.2 AHXR 當HAR反應被抑制時，宿主體內(nèi)少量的非α-Gal異種反應性抗體可以與異種供體器官內(nèi)皮細胞表面的抗原結合，導致補體激活，引發(fā)由NK細胞和巨噬細胞介導的細胞毒作用及活化內(nèi)皮細胞等并發(fā)癥，最終引起AHXR［8］。AHXR的病理表現(xiàn)為豬的腎臟內(nèi)皮細胞活化、血栓形成和血管收縮，進而導致腎臟損傷。目前抑制AHXR的主要策略是清除宿主體內(nèi)的非α-Gal異種反應性抗體。

2.1.3 T細胞介導的移植排斥 T細胞介導的免疫排斥也是導致異種器官移植失敗的主要因素。異種移植過程中識別異種抗原的T細胞活化分為直接激活與間接激活2種途徑。T細胞的直接激活是宿主的T細胞受體（T cell receptor，TCR）識別移植物抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC）表面的豬白細胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）分子，進而引發(fā)了T細胞介導的移植物排斥作用［9］。間接途徑的作用方式是宿主T細胞識別由宿主APC表面的MHC分子提呈的豬的抗原肽，進而引發(fā)宿主T細胞活化、B細胞活化以及體液異種排斥。T細胞活化會產(chǎn)生活化巨噬細胞和NK細胞的細胞因子，進而激活天然免疫系統(tǒng)，使移植物最終喪失功能［10］。與同種異體的T細胞介導排斥反應比較，異種移植T細胞直接激活引發(fā)排斥的程度與同種異體排斥相當，而間接激活途徑顯得更加劇烈［11-12］。T細胞介導的移植排斥會引發(fā)天然免疫反應，引起豬腎臟的功能障礙。

2.2 凝血調(diào)節(jié)功能異常

異種移植免疫反應是產(chǎn)生凝血功能障礙的主要原因［8，13］，主要表現(xiàn)為血栓性微血管病變和彌散性 血 管 內(nèi) 凝 血 （disseminated intravascular coagulation，DIC）［14］。由于少量抗體與移植物內(nèi)皮細胞結合、補體沉積均會導致內(nèi)皮細胞活化進而使內(nèi)皮細胞的抗凝血功能被破壞［15］。豬的凝血-抗凝系統(tǒng)與NHP模型凝血系統(tǒng)中的分子不相容也會加劇凝血障礙的程度，這是因為活化的血管內(nèi)皮細胞促進凝血，并且豬的抗凝血因子無法有效阻止血液凝固［16］。凝血系統(tǒng)紊亂使血管內(nèi)形成血栓，繼而引起移植物功能障礙，最終導致移植失敗。

2.3 生理功能兼容性問題

雖然豬的腎臟與人的腎臟在結構和大小上具有一定的相似性，但是在生理功能方面存在一定的差異，這些差異可能會影響移植腎在受體體內(nèi)的存活。如豬的腎臟可以通過尿素氧化酶代謝尿酸［17］；在腎素-醛固酮系統(tǒng)中，人的血管緊張素原無法被豬的腎素分解［9］；移植物在功能穩(wěn)定后會伴隨低磷血癥［18］等問題。其中最明顯的一點是移植后受體出現(xiàn)明顯的蛋白尿和低蛋白血癥，且需要補充白蛋白［18-19］。

蛋白尿的出現(xiàn)會引發(fā)腎病綜合征，使移植物喪失功能，這是生理功能障礙中最嚴峻的挑戰(zhàn)。血管內(nèi)形成血栓和感染均會導致蛋白尿的出現(xiàn)，組織學表現(xiàn)為腎小球系膜輕微擴張［20］。豬到狒狒的腎移植實驗［21］中發(fā)現(xiàn)：當帶血管的胸腺與來自同一供體的腎臟移植到受體體內(nèi)后，腎臟維持了正常的功能，延長了存活時間，但是術后出現(xiàn)了明顯的蛋白尿，說明蛋白尿并非由T細胞介導，也非由抗體介導引起。目前蛋白尿產(chǎn)生的原因尚未明確，需要繼續(xù)研究明確。

2.4 腎臟大小差異

由于豬與人的器官在生長速度上存在一定差異，因此配體與供體之間的匹配顯得尤為重要。在以青少年為例的特殊人群中，移植器官在有限的空間內(nèi)快速生長可能會導致功能性障礙［22］。SION等［23］在6例豬到NHP腎移植的研究中發(fā)現(xiàn)其中3例移植體的移植物持續(xù)生長，最終導致移植失敗。SHAH等［22］發(fā)現(xiàn)：當供體豬腎臟的體積與受體體質(zhì)量的比值大于25 cm3·kg－1時，供體腎功能將會受損，并最終喪失功能。其原因可能是受體循環(huán)系統(tǒng)中的血容量不足以維持移植物生長使移植腎的皮質(zhì)因缺血而受損，隨著腎臟在有限的腹腔內(nèi)生長，最終形成外源性的壓迫使移植物功能進一步受損。找出移植器官生長的原因對改善這一問題具有積極的意義，或許可以通過對調(diào)控器官生長的基因進行編輯［24］來改善這一狀況。

2.5 潛在感染風險

異種移植中，非人源器官引起的感染風險同樣值得引起重視。供體與宿主之間不同微生物的相互作用和宿主免疫功能的抑制會引起細菌或病毒感染。異種移植過程中，當宿主的免疫功能受到抑制后，宿主體內(nèi)的病原體和豬的相關病原體均有可能出現(xiàn)，早期基于小型豬與NHP異種移植的研究中，F(xiàn)ISHMAN等［25］在豬的器官中檢測到放線菌和鏈球菌。耐藥菌的出現(xiàn)與抗生素的應用有一定的相關性。

由于器官移植中移植物與宿主含有不同的MHC分子，T細胞介導的抗病毒反應受到抑制，病毒感染同樣較為常見，并且會因為移植排斥和免疫抑制等因素加重。在異種移植中，宿主可能會因此感染豬巨細胞病毒（porcine cytomegalovirus，PCMV）、豬嗜淋巴皰疹病毒（porcine lymphotropic herpesvirus，PLHV）和豬內(nèi)源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）等。在豬到NHP的移植研究中，豬巨細胞病毒只在腎移植過程中引起感染，導致消耗性凝血與早期移植物丟失［26-28］。豬嗜淋巴皰疹病毒具有物種特異性，不會引起宿主的全身感染［29］。豬內(nèi)源性逆轉錄病毒可能會通過插入效應引起宿主基因表達調(diào)控的改變，繼而引起無癥狀感染或增加癌變等風險［25］。

3 異種腎移植的研究進展

隨著分子生物學技術和免疫學技術的不斷發(fā)展，異種腎移植在多基因編輯豬、T細胞免疫抑制、低蛋白血癥與蛋白尿和跨種屬感染等方面均有顯著進展。尤其是基因編輯豬的出現(xiàn)使得免疫排斥和凝血功能異常等問題得到緩解。基因編輯豬的供體腎配合免疫抑制劑的應用極大地延長了NHP腎移植研究中移植腎的存活時間，為開展相關的臨床研究提供了基礎。

3.1 基因編輯豬在異種腎移植中的應用

通過基因編輯技術將表達α1，3Gal表位的基因敲除，使得供體器官內(nèi)皮細胞中不表達該抗原，消除了α1，3Gal介導的HAR反應［20］。YAMADA等［30］在2005年報道了采用GALT敲除（GalT-KO）豬的供體腎在狒狒體內(nèi)存活了83 d，并且維持了正常的肌酐水平。陳剛等［31］在急性體液異種排斥中發(fā)現(xiàn)高濃度的非抗Gal抗原的抗體，上述抗體介導了補體依賴的細胞毒作用，說明非抗Gal的抗體可以誘導AHXR。但是在T細胞耗竭的GalT-KO豬腎移植中并未發(fā)現(xiàn)AHXR反應［30，32］，表明該種非Gal抗體的產(chǎn)生可能是T細胞依賴的。

為了克服微血管病變和血栓形成所帶來的凝血障礙，出現(xiàn)了可以表達1個或多個補體調(diào)節(jié)蛋白（例如CD55和CD46［33-34］等）的GalT-KO豬。2004年，表達CD55的豬腎臟可在食蟹猴體內(nèi)存活90 d［35］。2015年HIGGINBOTHAM等［36］將CD55-GalT-KO豬的腎臟移植到低滴度抗豬抗體的猴子中發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合抗CD154單克隆抗體使受體存活多于130 d。有研究者［37-38］報道移植表達人凝血調(diào)節(jié)基因供體豬腎后的存活時間：其中體內(nèi)含有高滴度的抗豬非α1，3Gal抗體（Ig M和IgG）的狒狒存活了136 d，非α1，3Gal抗體滴度較低的2只狒狒存活到237 d和260 d，而且具有正常的腎功能。

目前借助ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas等基因編輯技術，產(chǎn)生了多種基因修飾豬［39］，使得腎臟在異種移植后的存活時間不斷延長（表1），有效地推動了異種移植領域的研究進程，隨著越來越多與免疫反應相關的基因位點的出現(xiàn)，基因編輯豬的應用將會更加廣泛。

3.2 T細胞免疫抑制策略

目前在異種腎移植中，抑制T細胞介導的免疫排斥的常見方案有T細胞耗竭和共刺激通路阻斷。根據(jù)2種抑制方案，多種藥物被應用于臨床前研究（表2）。T細胞耗竭的常用方法包括使用抗T細胞的單克隆或多克隆抗體、放射治療以及使用環(huán)磷酰胺等化療藥物［42］?？剐叵偌毎虻鞍祝╝ntithymocyte globulin，ATG）是耗竭T細胞的常用試劑，在異種腎移植的研究中使用ATG可延長受體生存期達2～3個月［43］。T細胞耗竭在克服T細胞介導的免疫排斥中較為重要。

表1 豬到NHP異種腎移植的移植物存活記錄Tab.1 Survival record of grafts in kidney xenotransplantation from pig to NHP

表2 T細胞免疫排斥中常用藥物Tab.2 Medicines commonly used in T cell immune rejection

胸腺是T細胞成熟與發(fā)育的場所，對維持宿主體內(nèi)理想的免疫微環(huán)境具有重要作用。異種移植中，切除受體胸腺并移植豬的胸腺，受體體內(nèi)重建的T細胞將豬的MHC分子識別為受體自身的MHC分子，進而引起T細胞的免疫耐受。YAMADA等［20］將GalT-KO豬的腎臟與帶血管胸腺一同移植至切除胸腺的狒狒體內(nèi)，腎臟的最長存活時間由30 d延長至83 d。說明誘導T細胞免疫耐受在克服T細胞引起的免疫排斥反應具有一定潛力，但豬胸腺內(nèi)的自身反應性T細胞能否完全去除仍未可知，誘導免疫耐受的方案仍具有理論上的風險。

T細胞的活化不僅需要TCR與MHC分子結合，同時也依賴于共刺激信號的遞送，阻斷共刺激信號可以導致T細胞失能。在阻斷共刺激信號的藥物中，抗人CD154單克隆抗體較為常用［43］。HIGGINBOTHAM等［36］構建的NHP模型顯示：CD154單抗阻斷T細胞的共刺激通路使得受體存活時間多于130 d。在CD28/CD80與CD40-CD154這2種阻斷方式的比較中，HIGGINBOTHAM等［36］發(fā)現(xiàn)：CD40-CD154可以有效阻止T細胞激活。有研究［41］表明：在選擇低滴度抗豬抗體的NHP模型的前提下，選擇性去除CD4+T淋巴細胞與抗人CD154單抗聯(lián)合用藥，可以使受體存活期達到400 d，說明CD4+T淋巴細胞在異種移植排斥中具有更關鍵的作用。因此T細胞耗竭與阻斷共刺激通路聯(lián)合應用可以有效延長異種腎臟的存活時間。雖然抗人CD154單抗可在一定程度上延長移植物的存活時間，但SCHULER等［48］在食蟹猴的同種異體腎移植研究中發(fā)現(xiàn)：應用了抗人CD154抗體的宿主在移植后出現(xiàn)了腎臟的可逆性功能衰退，血小板數(shù)量降低，甚至伴有血栓栓塞性血管病變導致的肺部出血的現(xiàn)象，而同樣應用了抗人CD154的食蟹猴自體腎移植中卻未觀察到此類現(xiàn)象。說明抗人CD154單抗具有引起血栓形成的潛在風險，并且不是由抗體自身的毒性引起。因此抗CD154單抗在臨床上的應用還存在較多限制。

3.3 蛋白尿和低蛋白血癥的研究進展

在人同種異體腎移植中，鞘磷脂磷酸二酯酶樣3b （sphingomyelin phosphodiesterase like 3b，SMPDL-3b）的缺失會導致局灶性腎小球硬化的患者在移植后出現(xiàn)蛋白尿［49］。TASAKI等［50］發(fā)現(xiàn)：豬到狒狒的腎移植實驗中，利妥昔單抗可以對豬足細胞中的SMPDL 3b提供保護，使蛋白尿得以延緩；體外實驗［22］研究結果顯示：SMPDL-3b對豬腎小球起重要作用?？笴D20利妥昔單克隆抗體可以與SMPDL-3b結合從而抑制腎小球損傷，說明利妥昔單抗可以起到延緩蛋白尿的作用。體內(nèi)實驗［50］也證明了這一點，但是該方法的效果并不持久，只能維持2～3周。足狀樹突細胞表達CD80，也可以呈遞抗原，有研究［51］表明：在腎病綜合征患者的尿液中CD80含量較高。在兒童腎病中常見的微小病變?。╩inimal change disease，MCD）中，CTLA-4可以與CD80結合，進而抑制足狀樹突細胞的激活，從而減輕MCD的癥狀。MCD同樣與CTLA-4的遺傳多態(tài)性有關［52-53］。在異種腎移植中，TANABE等［54］在患有腎病綜合征的樣本中發(fā)現(xiàn)：患病狒狒尿中的CD80表達增加，腎小球上也發(fā)現(xiàn)了CD80的表達，說明異種移植中的蛋白尿與CD80的表達有關；采用CTLA-4抗體與抗CD40L的免疫方案改善了移植GTKO豬腎臟的狒狒的蛋白尿的情況。CD80與CTLA 4在蛋白尿的預防中具有重要作用，通過減少CD80的表達可以減輕異種移植中蛋白尿的程度。

3.4 降低跨種屬感染風險的方法

可以通過供體篩選與抗生素的合理使用來降低細菌引起的異種移植感染風險。對供體豬群體進行血清學測試、顯微觀察和常見病原微生物的培養(yǎng)可以達到較為理想的效果［25］，用于異種移植的豬在生物安全設施中喂養(yǎng)也能杜絕來自外界環(huán)境的病原體感染。

PCMV與PHLV的感染風險可以通過嚴格篩選供體豬及圈養(yǎng)在生物安全設施中來避免［55］。豬內(nèi)源性逆轉錄病毒在所有豬組織中均有表達，其分型有3種（PERV-A、PERV-B和PERV-C），其中PERV-A和PERV-B的受體在人類體內(nèi)可以檢測到，PERV-C主要感染豬的細胞。PERV-A和PERV-B與PERV-C重組在體外實驗中被證實可以感染人的細胞［56］。目前擬解決逆轉錄病毒感染的方案有篩選缺失豬內(nèi)源性逆轉錄病毒表達基因或攜帶少量PERV-C型的供體、疫苗接種、RNA干擾和敲除表達豬內(nèi)源性逆轉錄病毒的相關基因［57］。GüELL等［58］采用CRISPR-Cas9技術靶向敲除了PK-15細胞系上表達豬內(nèi)源性逆轉錄病毒聚合酶的基因，并分離出100%不表達PERV的PK-15細胞系。

目前尚無任何證據(jù)表明內(nèi)源性逆轉錄病毒可以在宿主體內(nèi)存活超過48 h并傳播給人類，在相關臨床研究中也未發(fā)現(xiàn)抗PERV抗體以及整合前的病毒，關于其感染致病的風險還需進一步研究。

4 總結和展望

作為解決器官短缺的方案之一，異種移植的前景十分廣闊?；蚓庉嬝i的出現(xiàn)使得諸如HAR反應和凝血系統(tǒng)紊亂等障礙都得到了極大改善。目前通過采用多基因編輯的供體豬腎臟，聯(lián)合T細胞耗竭與阻斷T細胞共刺激通路的免疫方案，已經(jīng)極大延長了受體的存活時間。目前對豬進行基因編輯仍有巨大的操作空間，譬如敲除豬的SLA分子或下調(diào)其表達水平，插入人的MHC分子或者敲入諸如CTLA-4融合蛋白等，均可以通過減少外源性免疫抑制藥物的使用，最終實現(xiàn)誘導靈長類受體對豬腎臟的耐受［7］。供受體器官生長速度不一致同樣有望通過編輯調(diào)節(jié)器官生長速度的相關基因靶點來解決。有研究［59］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)新的異種反應性抗原，但異種移植后蛋白尿的發(fā)病機制等問題仍然需要繼續(xù)研究，潛在的感染風險是否存在以及如何規(guī)避依然需要進一步討論。