婁詩涵，汪強(qiáng)武，鄭海倫

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全世界常見的消化道惡性腫瘤之一。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，近幾年我國CRC的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢[1]。早期腫瘤病人可通過手術(shù)切除獲得良好預(yù)后，其5年生存率可超過90%。然而多數(shù)CRC確診時已為中晚期，無法達(dá)到理想的治療效果，5年生存率不到10%[2]。CRC中常常有代謝失常的表現(xiàn)[3]。泛醌-細(xì)胞色素c還原酶復(fù)合物核心蛋白1(ubiquinol cytochrome c reductase core protein 1，UQCRC1)是線粒體復(fù)合體Ⅲ的重要結(jié)構(gòu)亞基之一，參與組成線粒體氧化呼吸鏈，對維持正常線粒體功能和細(xì)胞代謝有著基礎(chǔ)性作用[4]。國內(nèi)外大量研究表明，UQCRC1在人類腫瘤中存在表達(dá)失調(diào)[5]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物之一，經(jīng)常用于腸癌的檢測中。但因其特異性與敏感性欠佳，常與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合使用[6]。本研究通過檢測CRC根治術(shù)后的組織標(biāo)本中UQCRC1的表達(dá)，分析其和血清CEA的相關(guān)性，初步探討UQCRC1在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2017-2018年蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院初診CRC手術(shù)切除得到的組織標(biāo)本52例，并收集所選病例術(shù)前血清 CEA 值。其中男28例，女24例，年齡20～80歲。腫瘤大?。骸? cm者27例，>5 cm者25例；組織學(xué)分型：腺癌49例，黏液癌3例；組織學(xué)分級：中分化及高分化共36例，低分化16例；TMN分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期22例，Ⅲ期20例，Ⅳ期8例；并從其中選取37例臨近癌旁組織作對照分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病人均已完善相關(guān)檢查(腸鏡活檢、臨床病理切片等)確診為原發(fā)性CRC，且為初診；術(shù)前未接受化療、放療、靶向及其他特殊抗腫瘤治療；所有病人均已在術(shù)前完善血清學(xué)CEA檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)腫瘤；合并急慢性嚴(yán)重炎癥、自身免疫性??；臨床資料不全者。診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)：參照《中國CRC診療規(guī)范(2017 年版)》[7]中提到的診斷標(biāo)準(zhǔn)及TNM分期、組織學(xué)分級等。

1.2 實驗方法 本研究已通過本院倫理委員會批準(zhǔn)?？贵wUQCRC1購自美國Abcam有限公司(產(chǎn)品編號ab125882)，免疫組織化學(xué)采用SP法染色。按照試劑盒說明書進(jìn)行染色程序，主要步驟包括：石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；自來水、蒸餾水各沖洗3遍；高壓抗原修復(fù)2 min；過氧化物酶阻斷10～15 min；蒸餾水沖洗3遍，PBS沖洗；加一抗溫箱孵育1 h，PBS沖洗3遍；滴加二抗，溫箱孵育30 min，PBS沖洗3遍；滴加DAB顯色3～5 min，自來水沖洗；蘇木精復(fù)染，水洗返藍(lán)；常規(guī)脫水透明，中性樹膠固定封片。

1.3 結(jié)果判定 以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，每張切片由本院2名病理科醫(yī)生采用下述方法評定[8]：標(biāo)志物根據(jù)顯色深淺得到染色強(qiáng)度：0分(陰性)、1分(弱)、2分(中)、3分(強(qiáng))；根據(jù)陽性染色區(qū)域相對于整個癌區(qū)百分比得到染色程度：<5%為0分、5%～25%為1分、>25%～50%為2分、>50%～75%為3分、>75%為4分。其結(jié)果為兩項得分乘積：最終得分≤2分為陰性，最終得分≥3分為陽性。血清CEA值參考值范圍為0～5 ng/mL,≥5 ng/mL即為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用χ2檢驗、Spearman等級相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織中UQCRC1的表達(dá)和血清CEA陽性率 UQCRC1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(見圖1)。本次研究結(jié)果顯示，52例癌組織中有16例(30.8%)UQCRC1低表達(dá)；37例癌旁正常組織中UQCRC1呈低表達(dá)的有4例(10.8%)，在α<0.05的水準(zhǔn)上，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.94，P<0.05)。Spearman等級相關(guān)性分析結(jié)果提示UQCRC1的表達(dá)與組織性質(zhì)顯著相關(guān)(r=-0.236,P<0.05)。CRC病人術(shù)前血清 CEA陽性率為40.4%(21/52)。

2.2 CRC組織中UQCRC1的表達(dá)與臨床及病理參數(shù)的關(guān)系 CRC組織中UQCRC1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05)，在病人不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、臨床分期上的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (見表1)。

表1 CRC組織中UQCRC1的表達(dá)與臨床及病理參數(shù)的關(guān)系[n;百分率(%)]

2.3 CRC組織UQCRC1和血清CEA表達(dá)水平的相關(guān)性 52例結(jié)腸癌組織中，UQCRC1表達(dá)陰性同時CEA表達(dá)陽性者占62.5%(10/16)。運(yùn)用Spearman等級相關(guān)分析得知，在α<0.05的檢驗水準(zhǔn)上，CRC病人癌組織中UQCRC1表達(dá)水平與術(shù)前血清CEA值呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.300)(P<0.05)(見表2)。

表2 CRC中UQCRC1、CEA表達(dá)的相關(guān)性(n)

3 討論

CRC是全世界絕大多數(shù)國家的一個健康問題。據(jù)報道，全世界每年有超過100萬人罹患CRC，遺傳和環(huán)境因素是CRC發(fā)生的重要條件[9]。在我國，CRC發(fā)病率逐年上升，且隨著一些危險因素如人口老齡化、不良飲食習(xí)慣等蔓延，其死亡率也處于明顯的上升趨勢[10]，居民生命健康受到嚴(yán)重威脅。盡早診斷和判斷癌變組織惡性程度對提高CRC病人的生存質(zhì)量至關(guān)重要。

UQCRC1是一種核DNA編碼蛋白，是參與合成線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ的11個重要亞基之一。UQCRC1在胚胎存活和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，SHAN等[11]的實驗發(fā)現(xiàn)敲除雜合子小鼠中的UQCRC1導(dǎo)致胚胎致死。而關(guān)于UQCRC1的表達(dá)與惡性腫瘤中的關(guān)系，KULAWIEC等[12]發(fā)現(xiàn)74%的乳腺癌病人UQCRC1陽性，僅34%的卵巢腺癌病人UQCRC1表達(dá)。后陸續(xù)有關(guān)于其在食管癌、胰腺導(dǎo)管腺癌中上調(diào)，在賁門癌、胃癌中表達(dá)下調(diào)的報道[13-14]。從目前考慮的機(jī)制上看，不可忽視的是UQCRC1表達(dá)與線粒體的關(guān)系。研究[11]證實UQCRC1對維持酵母中復(fù)合體Ⅲ的完整性至關(guān)重要。有關(guān)實驗[15-16]顯示，上皮來源的細(xì)胞和小鼠精母細(xì)胞中UQCRC1的缺失可導(dǎo)致線粒體功能障礙。YI等[17]的研究指出，UQCRC1有助于在心肌損傷期間維持H9c2細(xì)胞的線粒體功能。根據(jù)這些證據(jù)可推測，UQCRC1的異常表達(dá)可影響到人類線粒體功能正常狀態(tài)的維持。正常線粒體功能中斷會導(dǎo)致多種人類疾病的發(fā)生，其中就包括腫瘤的發(fā)生[18]。近年來，線粒體出現(xiàn)在癌癥研究中的次數(shù)大大增多。線粒體可調(diào)節(jié)生物代謝，是癌細(xì)胞代謝變化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物[19]。目前線粒體功能障礙在多種癌癥的轉(zhuǎn)移進(jìn)展中皆有報道發(fā)現(xiàn)[20]，如結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌等。線粒體障礙常產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，促進(jìn)DNA損傷和遺傳不穩(wěn)定性[21]。ROS是線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的主要來源于復(fù)合體Ⅲ的具有損傷作用的副產(chǎn)物[22]，ROS失衡是線粒體功能障礙主要機(jī)制之一，其在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和生存表型中皆發(fā)揮重要作用[19，23-24]。SHAN等[11]實驗還發(fā)現(xiàn)，UQCRC1缺乏致使小鼠線粒體膜電位和ATP產(chǎn)量下降，而ROS產(chǎn)量增加，可能原因在于UQCRC1的缺乏導(dǎo)致復(fù)合物Ⅲ活性的降低。

本實驗研究結(jié)果顯示，UQCRC1在癌組織中的表達(dá)下調(diào)率(30.8%)高于癌旁正常組織(10.8%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。UQCRC1參與組成線粒體氧化呼吸鏈，推測在結(jié)直腸細(xì)胞中UQCRC1的下調(diào)表達(dá)使細(xì)胞中的線粒體出現(xiàn)功能障礙，細(xì)胞能量代謝發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分析該蛋白表達(dá)水平與腫瘤的大小、分化程度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CRC組織中UQCRC1的下調(diào)表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步提示UQCRC1的存在與CRC侵襲有著密切聯(lián)系。LI等[25]通過研究證實UQCRC1表達(dá)下調(diào)與血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)表達(dá)升高之間存在正向相關(guān)關(guān)系，提出UQCRC1的下調(diào)可誘導(dǎo)VEGF-C的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移。這一考慮基于有關(guān)VEGF-C通過誘導(dǎo)淋巴管的生成促使淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移事件發(fā)生的相關(guān)報道[26]。

CEA是一種高分子糖蛋白，在人類的結(jié)腸、胃、汗腺等組織器官中存在。CEA在細(xì)胞的聚集、黏附、凋亡等過程中發(fā)揮作用，其與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。CEA增高可發(fā)生在多種惡性腫瘤中如胃腸道癌、乳腺癌、胰腺癌等，其中以結(jié)腸癌顯著[27-28]。研究[29]顯示CEA在CRC病人中的陽性率在40%～50%之間。此次研究結(jié)果顯示，CRC病人術(shù)前CEA陽性率為40.4%，UQCRC1表達(dá)與血清CEA表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性。這種負(fù)向關(guān)系考慮原因為：在結(jié)腸細(xì)胞中UQCRC1的表達(dá)下調(diào)或缺失，使得細(xì)胞線粒體失去正常功能，細(xì)胞代謝環(huán)境改變使得組織器官更易受到損傷，從而導(dǎo)致腸道細(xì)胞癌變。隨著CRC的發(fā)生，CEA含量增多，充分發(fā)揮了其在腫瘤細(xì)胞免疫逃避及細(xì)胞聚集、黏附中的重要作用，使腫瘤細(xì)胞更易向周圍組織器官擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[30]，進(jìn)一步促進(jìn)了癌癥的發(fā)展，使得UQCRC1的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。CEA作為標(biāo)志物在腫瘤的檢測中應(yīng)用廣泛，但因獨(dú)立檢測缺乏特異性，增加指標(biāo)可使陽性可信度增加。本實驗結(jié)果顯示，CRC組織中UQCRC1表達(dá)陰性者其血清CEA陽性率明顯高于UQCRC1表達(dá)陽性者，表明聯(lián)合兩種指標(biāo)檢測有助于評估結(jié)直腸腫瘤的狀態(tài)。

綜上所述，CRC中UQCRC1的表達(dá)下調(diào)與CRC的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，聯(lián)合UQCRC1和CEA兩個指標(biāo)檢測可為CRC的診治及病情評估提供一定理論依據(jù)。