楊靜文，唐小童,郭 輝，朱 悅，張?zhí)鹛?，?楊，吳 窮,汪 蕊

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，簡稱“肝癌”，是原發(fā)性肝癌最主要的病理類型，占原發(fā)性肝癌的75%～85%。2018年，全球范圍內(nèi)肝癌發(fā)病率位于惡性腫瘤第6位，癌癥相關(guān)死亡第4位，給人類帶來了沉重的健康負(fù)擔(dān)[1]。我國是名副其實的HCC大國和重災(zāi)國，約占全世界53.5%的比例，且致死率高達(dá)93%[2-3]。HCC起病隱襲，約80%病人在就診時即為晚期，失去了手術(shù)根治的時機(jī)。系統(tǒng)治療是無法切除的局部晚期和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性HCC的重要治療手段。盡管以索拉非尼為代表的多靶點(diǎn)小分子酪氨酸激酶抑制劑為晚期HCC帶來了希望，然而也只有中等程度的獲益。近些年，免疫檢查點(diǎn)抑制劑程序性死亡配體-1(programmed cell death protein 1,PD-1)/PD-L1(programmed cell death protein 1 ligand)單抗成為抗腫瘤藥物中的明星產(chǎn)品，已在多種實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中都顯現(xiàn)了突出療效。免疫檢查點(diǎn)抑制劑在晚期HCC中臨床療效也備受關(guān)注，CheckMate 040 Ⅰ/Ⅱ期隊列研究表明PD-1單抗(納武單抗)對晚期HCC病人表現(xiàn)出良好的安全性及耐受性[4]。盡管PD-1單抗為部分晚期HCC病人帶來了持久的客觀緩解率，然而仍有部分人群無法從PD-1單抗治療中獲益，可能和肝癌存在其他免疫抑制機(jī)制有關(guān)。因此，深入研究HCC發(fā)生相關(guān)的免疫機(jī)制，探尋改善現(xiàn)有免疫靶向藥物療效的方法具有重要臨床意義。人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒-H長端重復(fù)相關(guān)蛋白2(HHLA2)是新近發(fā)現(xiàn)的B7家族免疫檢查點(diǎn)分子，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)且與臨床預(yù)后不良相關(guān)[5]。因此，本研究通過免疫組織化學(xué)染色方法分別檢測免疫檢查點(diǎn)分子HHLA2和PD-L1在肝癌中的表達(dá)情況，并分析兩者表達(dá)相關(guān)性和與臨床病理參數(shù)及臨床預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步揭示肝癌發(fā)生的免疫機(jī)制，為探尋有效的免疫治療靶點(diǎn)提供依據(jù)?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2012-2016年經(jīng)手術(shù)切除的HCC病人石蠟組織樣本，其中90例HCC病人具有完整的病歷資料、生存隨訪資料和相對應(yīng)的癌旁組織(距切緣>1 cm)。術(shù)前均未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。90例HCC病人中男74例，女16例，年齡31～78歲；腫瘤直徑≤5 cm 63例，腫瘤直徑>5 cm 27例；有血管侵犯 21例，無血管侵犯69例；按第7版AJCC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期58例，Ⅱ期29例，Ⅲ期3例。病理分級參考Edmondson法：Ⅰ級14例，Ⅱ級52例，Ⅲ級23例，Ⅳ級1例；手術(shù)樣本經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 組織芯片的制定 每1例組織樣本，通過在 HE 切片確定典型癌及癌旁組織，之后在相應(yīng)的蠟塊上作好標(biāo)記，選擇20 mm×20 mm 孔徑的穿刺針，將組織按一定規(guī)則轉(zhuǎn)移至48 mm× 28 mm×15 mm 的蠟?zāi)Ｖ小；旌?97.5 g萊卡石蠟和2.5 g蜂蠟(2.5%)后反復(fù)加溫溶解，冷卻后制成上述蠟?zāi)４笮〉目瞻紫瀴K。在該蠟塊中內(nèi)設(shè)計18×10點(diǎn)組織陣列，用組織儀打孔(1.5 mm)制成組織芯片(TMA)模塊。固定TMA 蠟塊，55 ℃ 溫箱放置 1～2 h，待蠟將要完全溶解前取出，室溫冷卻，使蠟與新插入的小圓柱狀組織融為一體，取蠟塊放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 TMA蠟塊4 ℃預(yù)冷 4 h，后放置-20 ℃條件下20 min，快速取出切片機(jī)修正切片，連續(xù)切片10～20張切片備用，切片厚度為4 μm。切片42 ℃溫水展開，貼至含多聚賴氨酸切片黏合劑的載玻片，晾干，62 ℃ 烤片儀烤片3 min，58 ℃繼續(xù)烤片18 h，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎妹庖呓M織化學(xué)EliVision法檢測HHLA2和PD-L1的表達(dá)，具體操作步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。用已知的HHLA2和PD-L1陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。HHLA2(ab214327)多克隆抗體和PD-L1單克隆抗體(ab205921)均購自美國Abcam公司。

1.4 結(jié)果判定 HHLA2和PD-L1染色均定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞染色，染色結(jié)果采用IHC半定量法進(jìn)行分析，在高倍鏡下(×400)隨機(jī)取5個視野，計算每個視野下細(xì)胞的染色強(qiáng)度(I)和陽性染色細(xì)胞百分比(P)，取其平均值。免疫染色結(jié)果計算公式為H-score=I×P。HHLA2的I評分分別為：未見顯色染色(0分)；顯色染色為淺黃色(1分)；顯色染色為棕黃色(2分)；顯色染色為棕褐色(3分)。HHAL2的P評分分別為：0分為0%；1分為>0%～25%，2分為>25%～50%，3分為>50%～75%，4分為>75%～100%。HHLA2的結(jié)果判定為H-score 0分為陰性(-)，1 分弱陽性(1+)，2 分中等陽性(2+)，≥3 分的強(qiáng)陽性(3+)，H-score≥1分設(shè)定為HHLA2陽性[6]。PD-L1的I評分等級同HHLA2的I評分。PD-L1的P評分分別為：0分為0%，1分為>0%～10%，2分為>10%～50%，3分為>50%～100%。PD-L1的結(jié)果判定為H-score ≤1分為陰性(-)，2～3分弱陽性(1+)，4分中等陽性(2+)，≥6分強(qiáng)陽性(3+)，H-score≥3分設(shè)定為PD-L1陽性[7]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用配對χ2檢驗、成組設(shè)計χ2檢驗、Spearman 等級相關(guān)分析、Kaplan-Meier生存曲線法和Log-rank檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 HHLA2和PD-L1在 HCC組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，HHLA2和PD-L1在HCC組織及癌旁組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜中。HHLA2在HCC組織樣本中陽性表達(dá)率(49/90，54.4%)與癌旁組織(33/90，36.7%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1)。HCC組織中PD-L1的陽性表達(dá)率(52/90，57.7%)與癌旁組織(44/90，48.9%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。

2.2 HHLA2和PD-L1在 HCC組織中的表達(dá)的相關(guān)性 Spearman 等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，HCC組織中HHLA2 和 PD-L1 的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.566，P<0.05)(見表1)。

表1 肝癌組織中HHLA2與PD-L1表達(dá)的關(guān)系

2.3 HHLA2和PD-L1的表達(dá)與HCC病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 結(jié)果顯示：HHLA2的表達(dá)與病人的年齡、性別、有無血管侵犯、病理分級及血清AFP水平無關(guān)，和臨床分期及慢性乙型肝炎感染有關(guān)(P<0.05)(見表2)。PD-L1的表達(dá)與HCC病人的年齡、性別、有無血管侵犯、慢性乙型肝炎感染及血清AFP水平無關(guān)，與臨床分期及病理分級相關(guān)(P<0.05)(見表2)。

表2 HHLA2 和PD-L1的表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.4 HHLA2和PD-L1的表達(dá)與HCC病人臨床預(yù)后之間的關(guān)系 對90例肝癌病人不同HHLA2及PD-L1表達(dá)狀態(tài)的總生存時間進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，結(jié)果顯示：HHLA2陽性表達(dá)較陰性表達(dá)的肝癌病人中位總生存時間(mOS)差異無統(tǒng)計學(xué)意義[mOS:42個月vs 48個月，HR=1.481(0.928～2.362)，P>0.05]；PD-L1陽性表達(dá)的肝癌病人mOS同陰性表達(dá)的病人差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義[mOS:43個月vs 53個月，HR=1.522(0.949～2.443)，P>0.05](見圖3)。

3 討論

HHLA2是最近被鑒定出的一種新的免疫檢查點(diǎn)分子，屬于B7家族新成員，免疫活性與B7家族具有相似性，也被稱為B7-H5和B7-H7[8]。人HHLA2基因位于第3染色體q13.13區(qū)，編碼一種包含了414個氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，同其他B7家族成員在氨基酸序列上有23%～33%的同源性。不同與其他B7家族成員，HHLA2胞外具有3個Ig結(jié)構(gòu)域[9-11]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，人外周血單核細(xì)胞表面表達(dá)HHLA2蛋白，IFN-γ和 LPS可誘導(dǎo)B細(xì)胞表面HHLA2的表達(dá)，T細(xì)胞表面不表達(dá)HHLA2蛋白。人大多數(shù)正常組織中不表達(dá)HHLA2，僅在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞和腎臟、腸道組織、膽囊和乳腺上皮細(xì)胞少量表達(dá)。然而，多種惡性腫瘤細(xì)胞組織中存在HHLA2過表達(dá)的情況，且與病人的臨床預(yù)后相關(guān)。

研究[12]報道HHLA2高表達(dá)于三陰性乳腺癌組織中，且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床分期密切相關(guān)。肺癌作為一種免疫原性腫瘤，卻只有約20%病人表達(dá)PD-L1或?qū)D-1/PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑有治療反應(yīng)。然而，HHLA2在66%非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)，而在正常肺組織(包括肺泡型和Ⅱ型細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)中未見表達(dá)。EGFR突變?nèi)巳褐蠬HLA2表達(dá)顯著增高[13]。因此，HHLA2免疫檢查點(diǎn)在不表達(dá)PD-L1的腫瘤中可能起到非常重要的免疫調(diào)控作用。高表達(dá)HHLA2的骨肉瘤病人表現(xiàn)出更差的生存預(yù)后[14]。此外，在腎透明細(xì)胞癌[15]，口腔鱗狀細(xì)胞癌[16]、肝內(nèi)膽管癌[17]、膀胱尿路上皮癌[18]、胃癌[19]和結(jié)直腸癌[20]中均發(fā)現(xiàn)存在HHLA2過表達(dá)，且和臨床不良預(yù)后顯著相關(guān)。這些研究說明，HHLA2可能作為腫瘤新的免疫檢查點(diǎn)分子，參與腫瘤免疫逃逸過程，為腫瘤細(xì)胞生存提供機(jī)遇。

為了探索HHLA2在肝癌組織中的表達(dá)及其與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性，本研究通過免疫組織化學(xué)染色方法考察了HHLA2和PD-L1在肝癌中的表達(dá)及其相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HHLA2蛋白在肝癌組織中的表達(dá)較癌旁組織中升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，PD-L1在肝癌組織中的表達(dá)較癌旁組織也未觀察到顯著差異(P>0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)HHLA2的表達(dá)與臨床分期和慢性乙型肝炎感染有關(guān)。肝癌是炎癥相關(guān)性癌癥，腫瘤微環(huán)境(TEM)中，除了存在大量功能各異的基質(zhì)細(xì)胞外，還存在其分泌的各種細(xì)胞因子，包括干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等，它們對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了重要作用[21]。研究已證實IFN-γ可誘導(dǎo)人單核細(xì)胞表面表達(dá)HHLA2[10]，因此，我們推測慢性乙型肝炎感染病人TEM中IFN-γ可能和肝癌細(xì)胞表面HHLA2高表達(dá)有關(guān)，其確證關(guān)系和分子機(jī)制需要進(jìn)一步實驗證明。目前，關(guān)于HHLA2在肝癌中表達(dá)及與臨床預(yù)后的研究不多。國內(nèi)學(xué)者李國等[22]研究報道，HHLA2在肝癌組織中高表達(dá)，且進(jìn)展期和低分化肝癌組織中陽性表達(dá)率升高，提示HHLA2陽性表達(dá)與臨床分期和和組織分化程度相關(guān)。本研究結(jié)果同上述研究結(jié)果不一致，HHLA2是否參與了肝癌的發(fā)生過程以及能否成為肝癌免疫治療的潛在治療靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步探索。PD-L1在肝癌中的表達(dá)及其臨床意義研究較多，然而，PD-L1在肝癌中的陽性表達(dá)率差異較大，可能和抗體的選擇及判讀標(biāo)準(zhǔn)不一致有關(guān)。本研究考察了HHLA2及PD-L1在肝癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HHLA2與PD-L1的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，提示HHLA2可能協(xié)同PD-L1參與了肝癌的免疫逃逸過程。本研究未發(fā)現(xiàn)HHLA2和PD-L1的表達(dá)狀態(tài)與肝癌病人中位總生存時間之間的關(guān)系，HHLA2及PD-L1的表達(dá)是否為肝癌病人的預(yù)后相關(guān)因子還需要擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究。

綜上所述，免疫檢查點(diǎn)分子HHLA2和PD-L1在肝癌組織中陽性表達(dá)率較癌旁組織有升高趨勢，兩者之間表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，然而其表達(dá)狀態(tài)與肝癌病人生存時間無明顯相關(guān)。HHLA2是否能夠成為晚期肝癌未來潛在的免疫治療靶點(diǎn)仍需要進(jìn)一步研究探索。