陶 露，韋卓利，武世伍，承澤農(nóng)，江 浩，項(xiàng) 平

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種頭頸部常見惡性腫瘤，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，2018年全球新增NPC病例約有12.9萬(wàn)例，約占全年診斷出的所有癌癥的0.7%，早期NPC病人的主要治療方法是放射治療[1-3]。晚期病人國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南建議放化療和輔助化療或誘導(dǎo)化療聯(lián)合治療[4]。研究[5]表明，晚期病人10年總生存率低于50%，經(jīng)聯(lián)合治療的Ⅲ～ⅣA～B期病人30%以上發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這也是鼻咽癌NPC病人致死的主要原因。電壓門控鈉離子通道β4亞基(SCN4B/β4)是鈉離子通道的阻遏蛋白，也是一種細(xì)胞黏附分子，對(duì)細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)、遷移等有作用[6]。BON等[7]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中SCN4B/β4對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲發(fā)揮作用。目前對(duì)SCN4B/β4在NPC組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道，本研究檢測(cè)SCN4B/β4在NPC組織中的表達(dá),分析其與臨床因素和預(yù)后的相關(guān)性，為尋找NPC預(yù)后生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年6月至2014年7月收集90例在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院治療的NPC病人，其中男51例，女39例，年齡27～75歲，病人均經(jīng)病理檢查確診為鱗狀上皮細(xì)胞癌，臨床分期Ⅰ期18例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期30例，行病理檢查判定TMN分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。所有病人臨床資料完整，并自愿提供NPC組織標(biāo)本，活檢前均未接受過放療或化療，收集病人5年隨訪資料。此外，20份存檔的石蠟包埋正常鼻咽黏膜組織(主要為鼻咽黏膜慢性炎)標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 試劑 SCN4B/β4蛋白多克隆抗體(Affinity Biosciences,USA)及ElivisionTMPlus免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新)購(gòu)自公司，SCN4B/β4蛋白為兔抗人原液，工作濃度1∶200。

1.2.2 方法 采用ElivisionTMPlus免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SCN4B/β4蛋白表達(dá)情況，根據(jù)說明書操作:在10%甲醛溶液中固定NPC和非腫瘤性鼻咽組織標(biāo)本，石蠟包埋后將其切成連續(xù)切片，厚度為3 μm。脫蠟和水化，經(jīng)微波修復(fù)法在枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行組織切片抗原修復(fù)。組織切片滴加第一抗體，室溫下孵育1 h或4 ℃過夜，PBS沖洗，浸入反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫下孵育20 min，PBS沖洗，滴加酶標(biāo)抗兔IgG聚合物，室溫下孵育半小時(shí)，PBS沖洗，DAB顯色試劑顯色，DAB顯色試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。終止顯色，蘇木精(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)重新染色(如有必要可用1%鹽酸乙醇分化)，PBS返藍(lán)，標(biāo)本浸入梯度乙醇脫水，二甲苯清洗，中性樹膠封片(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。用PBS代替空白對(duì)照組一抗、二抗，其余步驟同上。

1.2.3 結(jié)果判斷 顯微鏡下觀察NPC組織，SCN4B/β4主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：細(xì)胞膜無(wú)著色，為陰性(-)；任何比例細(xì)胞為微弱、不完整著色，為弱陽(yáng)性(+)；>10%的細(xì)胞為完整但不均勻著色，呈弱至中等強(qiáng)度棕黃色，為陽(yáng)性(2+)；>30%的細(xì)胞為完整著色，呈強(qiáng)棕褐色，為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)；其中，“-～+”定義為蛋白低表達(dá)，“2+～3+”定義為蛋白高表達(dá)[8]。

1.2.4 分期方法 按國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC分期第8版NPC分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)入組的NPC病人進(jìn)行TNM分期[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析及Kaplan-Meier分析。

2 結(jié)果

2.1 SCN4B/β4蛋白表達(dá)與NPC臨床病理特征的關(guān)系 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SCN4B/β4蛋白在癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)(見圖1)；SCN4B/β4蛋白在對(duì)照組中高表達(dá)率為85.0%(17/20)，在NPC組織中高表達(dá)率為30.0%(27/90)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.31，P<0.01)。

2.2 SCN4B/β4蛋白表達(dá)與臨床因素之間的相關(guān)性 SCN4B/β4蛋白在不同性別、年齡NPC中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SCN4B/β4蛋白表達(dá)在不同T分期、N分期、M分期、臨床分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)，T1～T2期、M0期、Ⅰ～Ⅱ期SCN4B/β4蛋白高表達(dá)率高于T3～T4分期、M1分期和Ⅲ～Ⅳ期，隨N分期增加，SCN4B/β4蛋白高表達(dá)率下降(見表2)。SCN4B/β4蛋白表達(dá)與局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期有相關(guān)性(P<0.05)(見表3)。

表2 SCN4B/β4蛋白表達(dá)與臨床因素之間相關(guān)性[n；百分率(%)]

表3 SCN4B/β4蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析

2.3 SCN4B/β4蛋白表達(dá)水平與NPC病人預(yù)后分析 2017年6月至2019年7月進(jìn)行電話隨訪，分析病人5年生存率。5年的總生存(OS)率為67.8%，臨床Ⅰ期為94.4%，Ⅱ期為93.3%，Ⅲ期為81.5%，Ⅳ期為30.0%(見圖2A)。SCN4B/β4高表達(dá)生存率為85.2%，SCN4B/β4低表達(dá)5年生存率為60.3%，高表達(dá)SCN4B/β4病人的5年OS率高于低表達(dá)SCN4B/β4病人(χ2=5.35，P<0.05)(見圖2B)。

3 討論

NPC是一種具高度侵襲性的上皮組織的惡性腫瘤，在特定地區(qū)如東南亞地區(qū)流行，尤其中國(guó)南方人群的NPC發(fā)病率和死亡率明顯偏高。SCN4B/β4基因定位于染色體11q23.33，含有5個(gè)外顯子，編碼228個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白，β4氨基酸序列包括一個(gè)N端切除信號(hào)序列、一個(gè)細(xì)胞外5型免疫球蛋白樣(Ig)折疊、一個(gè)跨膜α螺旋和一個(gè)短胞內(nèi)C端[10]。電壓門控鈉離子通道是在可興奮細(xì)胞中產(chǎn)生動(dòng)作電位所需的跨膜蛋白，由一個(gè)α亞基和一個(gè)或幾個(gè)β亞基組成，其中β亞基(β1-β4)是調(diào)節(jié)細(xì)胞過程的重要多功能信號(hào)分子，如細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移[11]，與乳腺癌、前列腺癌及一些其他類型癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移行為有關(guān)。

侵襲性癌細(xì)胞具有重要的可塑性，使其能夠使用不同的侵襲模式，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的發(fā)展[12]。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力取決于侵入細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的能力，ECM是一種非細(xì)胞成分，由多種分子組成，包括蛋白質(zhì)、糖蛋白和蛋白多糖，在許多類型的腫瘤微環(huán)境中受到異常調(diào)節(jié)，具有不同的物理和化學(xué)特性，可提供剛度、孔隙度和空間結(jié)構(gòu)，可作為細(xì)胞遷移的載體，錨定或運(yùn)動(dòng)軌跡[13]。研究[14]證明，在未見成纖維細(xì)胞的腦腫瘤中，間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞似乎參與ECM的重塑，并在腦腫瘤中提供侵襲性基質(zhì)條件。SCN4B基因是可興奮組織中電壓門控鈉離子通道的輔助亞基，編碼β4蛋白并在正常上皮組織中表達(dá)，經(jīng)乳腺癌組織活檢，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中的β4蛋白表達(dá)水平不同，敲低SCN4B基因的表達(dá)可促使RhoA通路活性增強(qiáng)，同時(shí)ECM降解活性保持不變，過表達(dá)細(xì)胞中β4蛋白的C端可阻止RhoA通路過度活化，從而降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性[7]。本研究中，SCN4B/β4的高表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這也與上述SCN4B/β4抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制相符合。

研究[15]表明，檢測(cè)正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)組織中的SCN4B/β4蛋白表達(dá)水平，正常甲狀腺組織中SCN4B/β4蛋白陽(yáng)性表達(dá)一般為中度，在所檢測(cè)的4例PTC組織中，SCN4B/β4蛋白低表達(dá)的僅2例，而剩下的2例中SCN4B/β4蛋白完全不表達(dá)，由此表明，在PTC組織中SCN4B/β4蛋白表達(dá)水平下調(diào)。在乳腺癌中，與正常組織相比，SCN4B基因在腫瘤和侵襲性癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，隨著侵襲性的增加(從Ⅰ級(jí)到Ⅱ級(jí))，SCN4B基因的表達(dá)逐漸降低，在高級(jí)別腫瘤和轉(zhuǎn)移癌中幾乎完全不表達(dá)，過表達(dá)SCN4B基因，腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展及癌細(xì)胞的侵襲性明顯下調(diào)[7]。本研究中，NPC組SCN4B /β4表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，且NPC組SCN4B/β4蛋白高表達(dá)率低于對(duì)照組，這與上述結(jié)論一致。

研究[15]已證實(shí)，SCN4B/β4表達(dá)與PTC中的淋巴結(jié)侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，SCN4B/β4的表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中顯著下調(diào)，生存數(shù)據(jù)分析顯示SCN4B/β4表達(dá)也與病人的預(yù)后情況有關(guān)，在典型的PTC亞型中復(fù)發(fā)概率最高，SCN4B基因在復(fù)發(fā)病例中表達(dá)明顯下調(diào)，SCN4B表達(dá)與復(fù)發(fā)率和淋巴結(jié)侵襲率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，無(wú)殘留腫瘤、低TNM分期和高SCN4B表達(dá)(作為分類變量)或增加的SCN4B表達(dá)(作為連續(xù)變量)與有利的無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，TNM分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，NPC組織中SCN4B/β4表達(dá)越低。這與上述結(jié)論一致。本研究預(yù)后分析也顯示，SCN4B/β4低表達(dá)組5年生存率明顯低于SCN4B/β4高表達(dá)組，這說明SCN4B/β4高表達(dá)能明顯有利于NPC病人預(yù)后。

綜上所述，SCN4B/β4在NPC組織中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)與TNM分期及預(yù)后相關(guān)，這些結(jié)果表明，SCN4B/β4可能在NPC的轉(zhuǎn)移中起重要作用，可能成為NPC預(yù)后的生物標(biāo)志物。