劉慧勤 任海濤 高鑫雅 趙燕環(huán) 范思遠(yuǎn) 時英英 李瑋 張杰文 關(guān)鴻志

抗N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)腦炎是一可治的自身免疫性疾病，其特征是抗體介導(dǎo)的NMDAR丟失，導(dǎo)致神經(jīng)精神癥狀呈進行性惡化，包括精神障礙、記憶缺陷、癲癇發(fā)作、運動障礙、不自主運動、意識減退及自主神經(jīng)功能障礙等[1-2]。腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查是一診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、炎性脫髓鞘、腫瘤性及出血性疾病的實用方法，與腦脊液常規(guī)檢查比較，它不僅能提供炎癥程度的信息，而且在評價細(xì)胞形態(tài)方面更具優(yōu)勢[3]。目前有關(guān)抗NMDAR腦炎患者腦脊液檢查特點，尤其是腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查特點的研究較少。該研究通過分析抗NMDAR腦炎患者腦脊液檢查結(jié)果，旨在探討抗NMDAR腦炎的腦脊液細(xì)胞學(xué)特點及臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象收集2015-01-01—2018-12-31河南省人民醫(yī)院及北京協(xié)和醫(yī)院收治的抗NMDAR腦炎患者164例，其中河南省人民醫(yī)院69例，北京協(xié)和醫(yī)院95例?；颊呔?017年中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會頒布的《中國自身免疫性腦炎診治專家共識》抗NMDAR腦炎確診標(biāo)準(zhǔn)[4]，且基于CBA法檢測腦脊液抗NMDAR抗體陽性，并排除神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤、腰椎穿刺術(shù)穿刺損傷者。

1.2 方法

1.2.1資料收集：一般資料包括性別、年齡、起病至就診時間、是否患有腫瘤、腫瘤類型、首次發(fā)病/復(fù)發(fā)病程及神經(jīng)功能評分。神經(jīng)功能評分用改良Rankin量表(modified Rankin scale，mRS)于腰椎穿刺當(dāng)天進行評定。腦脊液檢查包括腦脊液常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)、抗NMDAR抗體滴度及寡克隆區(qū)帶結(jié)果。所有腦脊液數(shù)據(jù)均來源于急性發(fā)作期或復(fù)發(fā)期。如患者接受多次腰椎穿刺，僅收集第一次的腦脊液結(jié)果。

1.2.2抗NMDAR抗體檢測：患者均行腦脊液抗NMDAR抗體檢測，采用CBA法。試劑為德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司提供的間接免疫熒光抗谷氨酸受體抗體檢測試劑盒(批號：FA 111m-1005-3)，操作按照試劑盒說明書進行。腦脊液抗NMDAR抗體滴度分為1∶1或1∶10、1∶32、1∶100、≥1∶320。

1.2.3腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查：采用腦脊液細(xì)胞學(xué)沉淀室(自然沉淀法)制片。取0.5 mL腦脊液加入腦脊液沉淀室，置于4℃冰箱中過夜，待細(xì)胞自然沉淀并干燥后，采用邁-格-姬(May-Grun-wald-Giemsa，MGG)染色法[3]染色，置光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、分類及數(shù)量。依據(jù)鏡下細(xì)胞計數(shù)及形態(tài)，將炎性反應(yīng)程度分為4級：(1)正常：細(xì)胞數(shù)≤200個/0.5 mL且未見炎性反應(yīng)細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、激活淋巴細(xì)胞、激活單核細(xì)胞、漿細(xì)胞)；(2)輕度：細(xì)胞數(shù)≤200個/0.5 mL但可見炎性反應(yīng)細(xì)胞，或細(xì)胞數(shù)201～500個/0.5 mL；(3)中度：細(xì)胞數(shù)501～2000個/0.5 mL；(4)重度：細(xì)胞數(shù)>2000個/mL。依據(jù)鏡下細(xì)胞形態(tài)及分類將炎癥類型分為：(1)淋巴細(xì)胞性炎性反應(yīng)；(2)淋巴細(xì)胞+中性粒細(xì)胞性炎性反應(yīng)；(3)淋巴細(xì)胞+中性粒細(xì)胞+嗜酸性粒細(xì)胞性炎性反應(yīng)。并觀察有無激活淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞等。

1.2.4腦脊液一般檢查：包括顱內(nèi)壓測定、腦脊液常規(guī)細(xì)胞計數(shù)、腦脊液生化及寡克隆區(qū)帶。顱內(nèi)壓>180 mmH2O界定為高顱壓，腦脊液常規(guī)細(xì)胞數(shù)增高定義為白細(xì)胞數(shù)>5×106/L，且無紅細(xì)胞增多，腦脊液常規(guī)白細(xì)胞數(shù)<5×106/L界定為腦脊液常規(guī)細(xì)胞數(shù)正常，腦脊液蛋白升高定義為>0.45 g/L，腦脊液檢出而對應(yīng)血清未檢出的寡克隆區(qū)帶定義為特異性寡克隆區(qū)帶陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示；計數(shù)資料采用例或率表示，采用卡方檢驗；神經(jīng)嚴(yán)重程度與腦脊液檢查的相關(guān)性，以及腦脊液常規(guī)檢查與細(xì)胞學(xué)檢查間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料164例患者中，女性94例，男性70例，女∶男=1.34∶1；年齡2～65歲，平均(25.85±12.62)歲。首次就診患者139例(84.8%)，復(fù)發(fā)就診患者25例(15.2%)，起病至就診時間中位數(shù)為30 d，四分位數(shù)間距為45 d，mRS評分中位數(shù)為4分，四分位數(shù)間距為2分。18例女性發(fā)現(xiàn)畸胎瘤，1例女性發(fā)現(xiàn)胸腺瘤，1例男性發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀均早于腫瘤發(fā)現(xiàn)時間。

2.2 抗NMDAR抗體滴度164例患者均行腦脊液抗NMDAR抗體檢測，抗體均呈陽性，其中142例接受抗體滴度評價，其中滴度為1∶1或1∶10的患者24例(16.9%)，1∶32者59例(41.5%)，1∶100 者54例(38.0%)，≥1∶320者5例(3.5%)。

2.3 腦脊液細(xì)胞學(xué)164例患者均行腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查，均可見淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。檢測到中性粒細(xì)胞者23例(14.0%)，可見激活淋巴細(xì)胞者51例(31.1%)，可見漿細(xì)胞者16(9.8%)例。112例(68.3%)可見炎性反應(yīng)，其中輕度炎性反應(yīng)46例(28.0%)，中度炎性反應(yīng)58例(35.4%)，重度炎性反應(yīng)8例(4.9%)。炎性反應(yīng)類型為淋巴細(xì)胞性炎性反應(yīng)89例(54.3%)，淋巴細(xì)胞+中性粒細(xì)胞混合性炎性反應(yīng)22例(13.4%)。中性粒細(xì)胞比例為1%～80%，其中中性粒細(xì)胞比例<10%者11例，10%～50% 8例，>50%者3例。1例患者為淋巴細(xì)胞+中性粒細(xì)胞+嗜酸性粒細(xì)胞混合性炎性反應(yīng)，中性粒細(xì)胞比例為3%，嗜酸性粒細(xì)胞比例為2%?？筃MDAR腦炎患者腦脊液細(xì)胞學(xué)典型表現(xiàn)見圖1。

注：NMDAR：N-甲基-D-天冬氨酸受體，表1～3同；A、B：淋巴細(xì)胞性炎性反應(yīng)；C、D：淋巴細(xì)胞+中性粒細(xì)胞性炎性反應(yīng)；紅色箭頭示淋巴細(xì)胞；黃色箭頭示漿細(xì)胞；黑色箭頭示中性粒細(xì)胞

2.4 腦脊液一般檢查顱內(nèi)壓升高者占37.0%(54/146)例。164例患者均行腦脊液常規(guī)、生化檢查。腦脊液白細(xì)胞中位數(shù)10×106/L，四分位數(shù)間距32×106/L，其中105例(64%)白細(xì)胞數(shù)升高，白細(xì)胞中位數(shù)為25×106/L，四分位數(shù)間距53.0×106/L，白細(xì)胞數(shù)在(6～10)×106/L、(11～100)×106/L、>100×106/L的患者分別為26例(15.9%)、71例(43.3%)、8(4.9%)例。蛋白水平中位數(shù)0.36 g/L，四分位數(shù)間距0.26 g/L，其中54例蛋白升高，蛋白水平為(0.45～1.00)、(1.00～1.50)、>1.50 g/L的患者分別為43例(26.2%)、8例(4.9%)、3例(1.8%)。葡萄糖水平平均為(3.46±0.88)mmol/L，其中葡萄糖減低9例(5.5%)。氯為(123.46±4.49)mmol/L，氯減低23例(14.0%)。111例行寡克隆區(qū)帶檢查，其中特異性寡克隆區(qū)帶陽性51例(45.9%)。

2.5 腦脊液常規(guī)與腦脊液細(xì)胞學(xué)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示，164例抗NMDAR腦炎患者腦脊常規(guī)檢查白細(xì)胞計數(shù)與腦脊液細(xì)胞學(xué)白細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)(r=0.630，P<0.01)，腦脊液常規(guī)檢查白細(xì)胞分級與細(xì)胞學(xué)炎性程度分級呈正相關(guān)(r=0.592，P<0.01)。

2.6 神經(jīng)功能嚴(yán)重程度與腦脊液參數(shù)的相關(guān)性分析Spearman相關(guān)性分析顯示抗NMDAR腦炎患者mRS評分與腦脊液抗NMDAR抗體滴度呈正相關(guān)(r=0.357，P<0.01)，而與腦脊液常規(guī)檢查白細(xì)胞計數(shù)、腦脊液常規(guī)檢查白細(xì)胞分級、腦脊液細(xì)胞學(xué)白細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞學(xué)炎性程度分級無相關(guān)性(表1)。

表1 164例抗NMDAR腦炎患者mRS評分與腦脊液檢查的Spearman相關(guān)性分析

2.7 腦脊液細(xì)胞學(xué)漿細(xì)胞與寡克隆區(qū)帶的關(guān)系腦脊液細(xì)胞學(xué)漿細(xì)胞陽性與否與寡克隆區(qū)帶陽性與否間無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(表2)。

表2 抗NMDAR腦炎患者腦脊液細(xì)胞學(xué)漿細(xì)胞與特異性寡克隆區(qū)帶的關(guān)系

2.8 腦脊液常規(guī)細(xì)胞數(shù)正?；颊吣X脊液細(xì)胞學(xué)與mRS評分的關(guān)系腦脊液常規(guī)細(xì)胞數(shù)正?；颊吖?9例，其中26例(44.1%)腦脊液細(xì)胞學(xué)顯示有炎性反應(yīng)，33例腦脊液細(xì)胞學(xué)正常。mRS評分與腦脊液細(xì)胞學(xué)白細(xì)胞計數(shù)、炎性程度分級呈正相關(guān)(r=0.259，P=0.047；r=0.264，P=0.043)。腦脊液細(xì)胞學(xué)顯示有炎性反應(yīng)的患者mRS評分更重(χ2=5.544，P=0.019)。結(jié)果見表3。

表3 腦脊液常規(guī)細(xì)胞數(shù)正?？筃MDAR腦炎患者不同腦脊液細(xì)胞學(xué)結(jié)果組間mRS評分分布〔n(%)〕

3 討論

腦脊液常規(guī)、生化檢測是疑診腦炎患者的基本初篩檢查手段。該研究顯示，抗NMDAR腦炎患者腦脊液常規(guī)多表現(xiàn)為輕至中度的白細(xì)胞增高，少數(shù)可>100×106/L；腦脊液蛋白多正常或輕度升高；大部分患者腦脊液糖、氯正常，少數(shù)呈輕度減低。這與既往研究結(jié)果相似[1，5-6]。腦脊液白細(xì)胞、蛋白平均水平明顯低于細(xì)菌感染性疾病，與病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相似。少部分患者腦脊液細(xì)胞數(shù)明顯增高，細(xì)胞學(xué)呈現(xiàn)淋巴與中性粒細(xì)胞混合性炎性反應(yīng)，與結(jié)核、真菌等感染性疾病表現(xiàn)類似，此時正?；蜉p度異常的腦脊液蛋白、葡萄糖、氯水平有助于鑒別。

腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查是診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、炎性脫髓鞘、腫瘤性及出血性疾病的實用技術(shù)。相較于腦脊液常規(guī)，它不僅能提供炎性反應(yīng)程度的信息，在評價細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面更具優(yōu)勢[3]。該研究顯示，抗NMDAR腦炎腦脊液細(xì)胞學(xué)以淋巴細(xì)胞性炎癥為主，部分患者可見淋巴與中性粒細(xì)胞混合性炎癥，亦可見激活淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞。這些特點有助于對抗NMDAR腦炎機制的認(rèn)識。抗NMDAR腦炎免疫機制主要為體液免疫，淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞在其免疫過程中至關(guān)重要。在B細(xì)胞活化因子的作用下，記憶型B細(xì)胞到達(dá)大腦，經(jīng)抗原刺激、親和力成熟、克隆擴增等，分化為產(chǎn)生抗NMDAR抗體的漿細(xì)胞[7-9]。腦脊液中的 CD19+B 細(xì)胞和CD138+CD19+漿細(xì)胞是鞘內(nèi)合成免疫球蛋白的主要來源[10]。該研究中腦脊液細(xì)胞學(xué)可見漿細(xì)胞及部分患者特異性寡克隆區(qū)帶陽性為抗NMDAR抗體在鞘內(nèi)合成提供了有力證據(jù)。T淋巴細(xì)胞在抗NMDAR腦炎的免疫過程中亦發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞、Th1細(xì)胞可有效輔助生發(fā)中心外的B細(xì)胞反應(yīng)，促進抗體生成[11]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)部分抗NMDAR腦炎患者的腦脊液中可見中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞在抗NMDAR腦炎中的作用尚不明確，但中性粒細(xì)胞亦見于視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病患者的腦脊液細(xì)胞學(xué)[12]。在水通道蛋白4抗體的作用下補體激活，大量的中性粒細(xì)胞通過中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶依賴機制進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與視神經(jīng)脊髓炎病灶的發(fā)生[13-14]。由此作者推測中性粒細(xì)胞參與抗NMDAR腦炎的免疫過程，但具體機制尚需進一步探討。

該研究結(jié)果顯示，抗NMDAR腦炎患者腦脊液細(xì)胞學(xué)白細(xì)胞計數(shù)與腦脊液常規(guī)白細(xì)胞計數(shù)、腦脊液細(xì)胞學(xué)炎性程度分級與腦脊液常規(guī)白細(xì)胞分級有良好的相關(guān)性，提示腦脊液細(xì)胞學(xué)可為評估腦脊液炎性程度提供可靠信息。此外，該研究結(jié)果亦顯示，在急性發(fā)作期36%的患者腦脊液常規(guī)白細(xì)胞計數(shù)正常，這與既往報道的約15%～96%的抗NMDAR腦炎患者在第一次檢測時腦脊液常規(guī)無炎癥反應(yīng)的結(jié)論一致[15]。腦脊液常規(guī)無炎癥反應(yīng)不能排除抗NMDAR腦炎的診斷，這部分患者極易被誤診，造成免疫治療遲滯。亞組分析結(jié)果顯示，44.1%的腦脊液常規(guī)正?；颊吣X脊液細(xì)胞學(xué)可見炎性反應(yīng)，且這部分患者的神經(jīng)功能殘障程度更重，表明對于腦脊液常規(guī)正常的抗NMDAR腦炎患者，腦脊液細(xì)胞學(xué)可作為檢測炎性反應(yīng)的重要手段。

mRS評分是評價腦炎患者神經(jīng)功能嚴(yán)重程度的可靠、簡便工具[1，16-17]。該研究結(jié)果顯示腦脊液抗NMDAR抗體滴度與mRS評分呈正相關(guān)。這與Gresa-Arribas等[17]研究結(jié)果一致。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)對于腦脊液常規(guī)陰性的患者，腦脊液細(xì)胞學(xué)白細(xì)胞計數(shù)及炎性程度分級與mRS評分呈正相關(guān)，表明除腦脊液抗NMDAR抗體滴度可作為評估神經(jīng)功能嚴(yán)重程度的工具外，對于腦脊液常規(guī)陰性的患者，腦脊液細(xì)胞學(xué)白細(xì)胞計數(shù)、炎性程度分級也可作為評估神經(jīng)功能受損嚴(yán)重程度的實驗室指標(biāo)。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，約2/3的抗NMDAR抗體腦炎患者腦脊液細(xì)胞學(xué)可見炎性反應(yīng)，淋巴細(xì)胞性炎性反應(yīng)是最常見的炎性反應(yīng)類型，中性粒細(xì)胞可見于部分患者，嗜酸性粒細(xì)胞少見。激活淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、特異性寡克隆區(qū)帶可見于部分患者。腦脊液細(xì)胞學(xué)可檢測到部分腦脊液常規(guī)未顯示的炎性狀態(tài)，這部分患者的神經(jīng)功能殘障程度相對更重。腦脊液細(xì)胞學(xué)具有發(fā)現(xiàn)腦脊液常規(guī)陰性者炎性反應(yīng)的檢測能力及評價抗NMDAR腦炎患者神經(jīng)功能嚴(yán)重程度的價值，可作為評估抗NMDAR腦炎的重要方法。