齊 潔，張 波，蔣 麗，張 鈞

生理性心肌肥大是心肌在細胞、分子層面因受到機械刺激后發(fā)生一系列的變化后形成的，表型主要有心臟體積、形態(tài)與功能等的改變[1]。有學者[2-4]研究已證實長期規(guī)律適宜強度的運動所誘導的心臟肥大對健康人群及心臟疾病患者均具有積極作用，正常健康人群的心臟病患病風險降低，心臟病病人的心功能可得到有效改善。常蕓等[5]的研究也早已證實神經(jīng)-內分泌激素在運動性心臟肥大（exercise-induced cardiachypertrophy，ECH）過程中扮演重要角色。近年來許多學者[6-7]將研究熱點關注于自噬在心肌肥厚/心肌重構中的重要作用。此外，馬曉雯等[8]通過實驗證明了在耐力性運動后心肌自噬的活性增加，但是，在ECH模型中心肌自噬水平與生理性心肌肥大產(chǎn)生的規(guī)律及相關機制，仍尚未被完全闡明。

目前，越來越多的研究者開始關注運動訓練對于心肌細胞自噬的影響。但鮮有報道系統(tǒng)闡述關于耐力運動訓練對心肌細胞自噬及自噬相關基因表達的影響。相關研究表明，自噬的發(fā)生是一個動態(tài)的過程。這一過程被理解為自噬軸。也有研究[9-11]分析自噬可能成為調控心肌肥厚的靶點。本研究通過建立10周游泳運動誘導的ECH動物模型，觀察了ECH中心肌細胞形態(tài)與心肌細胞自噬現(xiàn)象的變化，通過實驗研究自噬軸中的自噬相關基因LC3B、Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1、SQSTM1的表達變化，探討了長期耐力運動對大鼠心肌細胞自噬的影響。而自噬需要精準調控，已有研究[12-13]報道微小RNA（microRNA，miRNA）在不同組織細胞自噬通路調控中扮演著重要角色。本研究我們通過生物信息學預測了在運動性心肌肥大中與自噬相關基因具有靶向調控作用的miRNAs，并驗證了相關miRNAs的表達水平，初步確定了長期游泳運動在改變心肌miRNAs表達水平后，通過miRNAs調控自噬而誘導了運動性心肌肥大。為ECH的形成機制提供了依據(jù)，也為建立健全運動員心臟的保護機制和心血管疾病人群運動處方的制定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要試劑：ECL發(fā)光液購于美國Thermo公司，TRⅠzol、反轉錄試劑盒及RT-qPCR擴增試劑盒均購自TAKARA公司，兔抗單克隆抗體LC3B、Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1和SQSTM1等購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司，二抗（HRP標記的山羊抗兔和FⅠTC標記的山羊抗兔抗體）也均購自CST公司，PVDF膜購自美國Ⅰnvitrogen公司，DAPⅠ染色劑購自北京索萊寶生物公司，mRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，miRNAs引物由華大基因生物公司設計與合成。

主要儀器：BM-Ⅱ型病理組織包埋機、德國Leica切片機、DHG9000烘烤箱、德國Leica熒光顯微鏡、美國Bio-Rad電泳儀與轉膜槽、Tanon Multi凝膠成像系統(tǒng)、日本OlymPus光學顯微鏡、日本HⅠTACHⅠ透射電子顯微鏡、德國Eppendorf低溫高速離心機、天根高速組織勻漿機、美國ABⅠ7500 qPCR儀、One Drop*OD-1000超微量紫外分光光度計等。

1.2 實驗動物分組及運動性心肌肥大動物建模

健康6周齡雌性Sprague-Dawley大鼠40只，體重（150±20）g（上海斯萊克實驗動物有限公司）。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)（4只/籠），輻照鼠用滅菌飼料（南通特洛菲實驗動物飼料有限公司）飼養(yǎng)。室溫22～24℃，空氣濕度40%～70%，光照時間為12 h/天。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分成對照組（control group，CON組）和運動性心肌肥大模型組（exercise group，EX組），每組20只。分組后再適應性運動1周至雌性大鼠性成熟期（一般為8周齡），此時大鼠情緒較為穩(wěn)定，之后開始正式建模運動訓練。

依據(jù)T.G.BEDFORD動物運動訓練負荷標準[14]，通過參照T.FERNANDES等[15-16]的運動訓練方案，建立ECH動物模型。EX組大鼠進行10周無負重游泳運動，游泳運動方案詳見下表（見表1）。大鼠游泳運動在150 cm×60 cm×70 cm規(guī)格的游泳缸內進行，水溫控制在（31±1）℃。

表1 大鼠10周游泳運動方案Table1 A 10-Week Swimming Protocol

1.3 動物取材與樣本制備

用10%水合氯醛（40 mg/100 g體重）對大鼠進行腹腔麻醉。迅速打開胸腔，摘取心臟，生理鹽水漂洗后、濾干，并稱量全心重量。分離左心室后，并稱量、記錄左心室重量。取心尖處1 mm×1 mm×1 mm大小心肌組織放入2%戊二醛固定液，用于透射電鏡檢測。切取左心室壁，經(jīng)多聚甲醛固定后，組織經(jīng)石蠟包埋、切片后，待用。剩余組織-80℃保存，用于心肌組織RT-qPCR和Western blot實驗。

1.4 心肌組織染色

心肌LC3B免疫熒光：常規(guī)石蠟切片制片，用檸檬酸鈉進行抗原修復，PBS洗滌3次，3 min/次。5%封閉液37℃孵育120 min后，每個待測樣品滴加LC3B（1：1 000，CST）40 uL，4℃過夜。次日復溫后PBST洗滌3次，10 min/次。熒光二抗Alexa55（51：800）于37℃避光孵育120 min，PBS避光洗滌3次，5 min/次。加入DAPⅠ（1：1 000，北京索萊寶）充分混勻、孵育。PBS洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡鏡下關觀察（綠色熒光為陽性顆粒）。

心肌蘇木素-伊紅（HE）染色：所取心肌組織在酒精梯度脫水和常規(guī)梯度酒精脫水后，依次進行二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切片（5μm厚），HE染色，在中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察，并進行圖像采集。

1.5 透射電鏡觀察大鼠心肌超微結構

取大鼠左心室心尖部約1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，于4℃戊二醛磷酸緩沖液固定液中，固定24 h。常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色后制成50 nm左右的超薄切片，透射電鏡下觀察心肌組織自噬小體及心肌超微結構。

1.6 大鼠心功能檢測

游泳運動結束后24 h，大鼠吸入異氟醚麻醉。待大鼠穩(wěn)定后將其固定，取仰臥位，左心區(qū)脫毛。通過使用高分辨率動物超聲系統(tǒng)（Visual Sonics Vevo770）對實驗大鼠進行超聲心動圖檢測，采集兩維超聲圖像，進行心臟M型超聲檢測，心臟功能分析檢測等。記錄：二尖瓣口血流E峰與A峰比值（MV E/A）、室間隔厚度-舒張期（ⅠVS-d）、室間隔厚度-收縮期（ⅠVS-s）、左室舒張末內徑（LVⅠD-d）、左室收縮末內徑（LVⅠD-s）、左室后壁厚度-舒張期（LVPW-d）、左室后壁厚度-收縮期（LVPW-s）、左室質量（LV mass）、全心指數(shù)（HMⅠ）、左室指數(shù)（LVMⅠ）、射血分數(shù)（EF）、左室縮短分數(shù)（FS）、左室容量-舒張期（LV Vol-d）、左室容量-收縮期（LV Vol-s）等指標后，綜合評定大鼠心功能。

1.7 Western blot

采用RⅠPA強裂解液提取大鼠心肌組織總蛋白，使用BCA法對心肌組織進行蛋白定量。在10%或12%SDS-PAGE電泳分離后，進行轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，而后在TBST洗膜后依次加入1：1 000兔抗大鼠LC3B、Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1和SQSTM1一抗，室溫孵育60 min后置于4℃過夜。次日加入HRP標記的羊抗兔ⅠgG二抗抗體（1：5 000）孵育90 min，再次用TBST洗膜后，進行ECL發(fā)光。GAPDH設定為內參。

1.8 RT-qPCR

用TRⅠzol試劑提取心肌總RNA，測定總RNA的濃度與純度。嚴格按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書操作步驟合成cDNA，RT-qPCR法測定心肌ANP、α-actin、α-MHC、β-MHC、SERCA-2α及自噬相關基因LC3和Beclin1的mRNA表達量，內參為GAPDH。RT-qPCR擴增反應條件如下：95℃10 min，1個循環(huán)；95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)；72℃10 min。利用2-△△Ct法計算相對基因表達量。引物由上海生工生物技術公司合成，各基因上下游引物序列見表2。

用TRⅠzol試劑提取心肌總RNA，按microRNA反轉錄試劑盒（TaKaRa）說明書進行加尾反轉錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進行qPCR反應。引物由華大基因生物工程有限公司合成，U6為內參。反應條件如下：95℃30 s，1個循環(huán)；95℃5 s，60℃20 s，39個循環(huán)。每個樣品重復檢測3次。利用2-△△Ct法計算mi RNAs的相對表達量。

表2 基因上下游引物序列Table2 Gene Forward and Reverse Primer Sequences

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行處理，采用獨立樣本T檢驗進行統(tǒng)計學分析。顯著性差異選擇P＜0.05和P＜0.01水平。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。

2 實驗結果

2.1 運動性心肌肥大動物模型評價

10周游泳運動訓練后，從HE染色結果可觀察到，CON組大鼠心肌排列整齊、緊密，EX組大鼠心肌纖維明顯變粗，排列規(guī)律但有間隙，心肌細胞直徑顯著增加（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠心肌HE染色圖（×400）Figure1 HE Staining of Left Ventricle in Rats

圖2 各組大鼠心肌細胞直徑比較Figure2 Cooperate with the Myocyte Diameter in Rats in Various Groups

本研究通過心動超聲綜合評定了運動組大鼠的心功能，表3結果顯示，與CON組大鼠比較，EX組大鼠MV E/A比值、LVⅠD-d/s、LVPW-d、HMⅠ和LVⅠM均極顯著性提高（P＜0.01），LV mass、LV Vol-d、EF和FS均顯著上升（P＜0.05），提示10周運動后，運動組大鼠心功能顯著增強。

表3 大鼠超聲心動指標比較Table3 Comparison of Echocardiography Indicators of Rats

為了排除病理性心臟形成，本研究檢測了心肌病理標志物的表達水平。如圖3結果所示，10周游泳運動訓練后，CON組與EX組大鼠心肌ANP、α-actin、SERCA-2αmRNA的表達量以及α-MHC/β-MHC比值均無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 心肌病理性標志物的mRNA表達量Figure3 mRNA Expression of PathologicalMarker in Rats'Left Ventricle

2.2 運動性心肌肥大大鼠心肌自噬變化

透射電鏡結果顯示，EX組大鼠心肌組織出現(xiàn)典型的雙層膜結構，而CON組大鼠心肌排列規(guī)律整齊，未觀察到有典型的雙層結構出現(xiàn)（見圖4）。心肌LC3B免疫熒光結果表明，LC3B陽性顆粒呈綠色熒光，DAPⅠ為細胞核標記物，呈藍色熒光（見圖5）。與CON組比較，EX組心肌細胞LC3B陽性顆粒數(shù)量顯著增加（P＜0.01）。RT-qPCR結果所示（見圖6、圖7），10周游泳運動訓練促進了大鼠左心室LC3ⅡmRNA的表達水平，且與CON組相比EX組大鼠心肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01）。同時，10周游泳運動訓練也顯著提高了大鼠左心室Beclin1 mRNA的表達量（P＜0.01）。由Western blot結果可知，10周游泳運動訓練后，與CON組相比，EX組大鼠左心室LC3、Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1蛋白表達水平均顯著上調（P＜0.01或P＜0.05），左心室SQSTM1蛋白表達水平顯著下調（P＜0.01）。表明ECH大鼠心肌自噬水平增強。

圖4 各組大鼠心肌透射電鏡圖（×15 000）Figure4 Transmission electron microscope of Left Ventricle in Rats to Observe Autophagosome

圖5 大鼠心肌LC3B免疫熒光Figure5 LC3B Immunofluorescence in Rats

圖6 各組大鼠左心室LC3和Beclin1 mRNA表達水平比較Figure6 mRNA Expression of LC3 and Beclin1 of Rat Left Ventricle in Various Groups

2.3 運動性心肌肥大大鼠左心室miRNAs表達量變化

圖8顯示了ECH動物模型中具有差異表達的miRNAs，通過生物信息學在線預測軟件Targetscan（http：//www.targetscan.org）和miRDB（http：//mirdb.org/）預測，我們靶定了與自噬相關的miRNAs。結果表明10周游泳訓練后，與CON組相比，EX組大鼠左心 室miR-26b-5p（靶 向ULK1）、miR-204-5p（靶 向LC3B）、miR-497-3p（靶 向Atg7）和let-7a-5p（靶 向Atg4B）表達水平均顯著下調（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），而預測靶向作用于自噬受損蛋白SQSTM1的miR-181a-5p表達量發(fā)生顯著上調（P＜0.01）。

圖7 各組大鼠左心室自噬相關基因蛋白表達水平的變化Figure7 Protein Expression Changes of Autophagy-related Genes of Rat Left Ventricle in Various Groups

圖8 各組大鼠左心室miRNAs表達水平的變化Figure8 miRNAs Expression Changes of Rat Left Ventricle in Various Groups

3 分析與討論

通過對運動組大鼠左心室壁進行HE染色，結果發(fā)現(xiàn)，10周游泳運動訓練后，運動組大鼠心肌細胞排列較整齊，大小、分布均勻，心肌細胞核有所增大，肌纖維雖出現(xiàn)少許斷裂，但總體結構仍很規(guī)律、正常。本研究在設定運動強度時參照了前人[14]研制的動物運動負荷標準，因此大鼠進行60 min游泳運動屬于中等強度運動。有學者[15]通過對比與評價2種游泳方案建立的運動性心肌肥大模型，發(fā)現(xiàn)本研究中所參考的運動方案比每天一次60 min為期10周的方案所建立的心肌肥大模型表型更明顯。且從本研究中運動性心肌肥大組大鼠心肌病理學指標檢測結果來看，運動組大鼠心肌并未顯示有病理學改變，由此可見，10周中等強度游泳運動可使心肌細胞增大增粗，發(fā)生生理性改變，形成運動性心肌肥大。相關研究[17]認為，在一定范圍內心肌細胞體積增加的程度與運動強度、運動時間等呈正相關。雖然病理性心肌肥大與生理性心肌肥大的外部表型特征相差甚微，但是病理狀態(tài)下，心肌細胞內的收縮蛋白α-MHC呈現(xiàn)向β-MHC轉化的顯著趨勢，提示心肌細胞受損。而ECH心肌細胞中的轉化則是相反的[18]。本研究通過此種方案建立模型，排除了10周游泳運動導致的病理性心肌肥大，提示10周游泳訓練成功建立了運動性心肌肥大動物模型。

細胞自噬，是物種在進化過程中表現(xiàn)出的高度保守的代謝機制。已有研究表明，心肌細胞的自噬水平上調可以由適宜強度的運動訓練來實現(xiàn)，不僅可以維持心肌細胞穩(wěn)態(tài)，還可以減少心肌細胞凋亡。當外界刺激（如低氧、機械力等）細胞或細胞處于饑餓條件下時，細胞自噬起始信號被觸發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，ULK1是啟動細胞自噬的重要門控開關。哺乳動物同源物Beclin（l酵母Atg6）被磷酸化后從細胞內質網(wǎng)解離、釋放，與ⅠⅠⅠ類磷酸肌醇3激酶（classⅢphosphatidylinositol-3-kinases，classⅢPⅠ3K）Vps34相結合，從而形成兩個泛素樣系統(tǒng)：即Atg12-Atg5和微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3（microtubule-associated proteinⅠlight chain 3，LC3）-磷脂 酰 乙 醇 胺（phosphatidylethanolamine，PE）；通 過classⅠⅠⅠPⅠ3K的催化，Atg7與Atg10分別發(fā)揮El、E2泛素酶作用，而后促進Atg12與Atg5共價結合，并在招募Atgl6后形成三聚體，結合到自噬前體上，參與自噬小體的擴張；LC3的羧基端被Atg4切割，產(chǎn)生LC3-Ⅰ，在Atg3、Atg7及Atgl6復合體發(fā)揮E3泛素連接酶的作用下，LC3-Ⅰ與PE以酰胺鍵形式，結合形成LC3-PE/LC3-Ⅱ[19-21]，繼而與自噬小體膜緊密聯(lián)合，促進形成自噬小體。已有研究[21]表明，LC3-Ⅱ是細胞自噬泡膜的標記物，LC3-Ⅱ的表達水平可直接反映某一時刻自噬激活的程度。由此可見，自噬啟動后，其整個過程有Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12等這些關鍵蛋白的參與。

有學者[22]在Atg5-/-小鼠心肌及沉默Atg7-/-基因后發(fā)現(xiàn)，心肌細胞自噬水平均顯著降低，心肌產(chǎn)生肥大表型。由此可見，自噬異常導致心肌蛋白質和細胞器的異常聚積，可能是導致心肌肥大的重要機制。而運動作為一種機械性刺，可通過影響心肌細胞的自噬活性而平衡運動中或運動后恢復期心肌細胞的代謝。還有研究[23]發(fā)現(xiàn)，耐力運動可能會通過阻止小鼠心肌Beclin1-BCl2復合物解離，從而使自噬活性極度減弱。此外，有研究通過5周運動干預發(fā)現(xiàn)CHⅠP-/-小鼠由于自噬的代償性激活（表現(xiàn)為Atg5、Atg7表達水平顯著增加，LC3-ⅠⅠ顯著上調，自噬活性大幅度提高），使心肌蛋白質質量提高，最終參與抑制了小鼠心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。提示在ECH中心肌細胞自噬扮演著重要角色，其不僅可以控制正常水平的心肌蛋白質質量，還能夠保持心肌細胞正常的結構與生理功能。自噬，能夠通過ALP途徑清除運動刺激下心肌產(chǎn)生與代謝后異常的蛋白質、自由基等產(chǎn)物[24]，將其轉換成能源物質（如ATP、氨基酸、游離脂肪酸、核苷酸等），平衡與調節(jié)心肌細胞能量代謝，保證心肌蛋白質質量；另一方面，還能夠逆轉蛋白質合成與降解的失衡，而抑制心肌過度肥大[25-26]。已有研究[27]認為，心肌細胞分化與再生能力有限，自噬可以作為其促進物質循環(huán)及細胞自我更新的途徑之一。因此，心肌細胞自噬不僅可以維持心臟功能還可以維持心肌細胞活力[28-29]。

Beclin1是最早自定位在自噬前體結構中的自噬相關基因，可調控自噬水平。同時，目前大多數(shù)自噬研究所采用的檢測是LC3，尤其是LC3Ⅱ表達水平。LC3Ⅰ轉化成LC3Ⅱ后，其定位在自噬體膜上，是公認的自噬發(fā)生的標志，所以LC3Ⅱ表達水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值與自噬水平呈正相關。P62又稱為SQSTM1，在降解胞漿中錯誤重疊的蛋白時，p62是自噬過程中底物識別的重要配體蛋白。有研究表明，SQSTM1作為自噬過程中的選擇性接頭蛋白，也在自噬中發(fā)揮了重要作用。SQSTM1在泛素化后可促進自噬活性下降。在正常的自噬過程中，細胞質中SQSTM1蛋白可不斷被降解。當自噬活性減弱或在自噬功能缺陷時，SQSTM1蛋白會在細胞質中不斷堆積，因此，SQSTM1/p62被認為是自噬活性受損的標記蛋白之一。本研究的結果也證明了：10周中等強度游泳訓練使大鼠左心室自噬標記基因Beclin1和LC3Ⅱ表達水平顯著上調。ECH模型大鼠左心室自噬相關蛋白ULK1、Atg4B、Atg5、Atg7和Atg12表達水平均顯著上調，左心室SQSTM1表達水平顯著下調。

微小RNA（microRNA，miRNA）的發(fā)現(xiàn)在近來的研究中為闡明和研究ECH的發(fā)生機制提供了新的視角。一些研究通過功能獲得和缺失的方法進一步確認了miRNA的調控路徑，在ECH和病理性心肌肥大心臟模型中，某些miRNA表現(xiàn)出不同的變化趨勢，這也為闡釋兩種不同的心臟肥大調節(jié)機制提供了新的證據(jù)。miRNA已成為心血管疾病治療潛在的靶點，應用前景廣泛。前期，我們已通過建立ECH動物模型，利用microarray生物芯片分析了運動組大鼠心肌具有表達差異的miRNAs[30]。

自噬過程需要非常精準的調控。已有研究[20-21，31-32]表明，miRNA在不同組織細胞自噬通路調控中具有重要作用。我們通過Targetscan和miRDB在線生物信息學軟件預測分析發(fā)現(xiàn)：ULK1、SQSTM1、Atg4B、LC3 B、Atg7的3’UTR區(qū)可能分別與rno-miR-26b-5p、rno-miR-181a-5p、rno-let-7a-5p、rno-miR-204-5p、rno-miR-497-3p存在結合位點，這些miRNA可能通過作用于其預測靶基因，從而實現(xiàn)miRNA通過自噬調控運動性心肌肥大的功能。本研究結果表明，10周游泳運動訓練后，ECH大鼠左心室miR-26b-5p表達量顯著下調，其預測靶基因ULK1蛋白表達水平顯著上調；miR-181a-5p表達量顯著增加，其預測靶基因SQSTM1表達水平顯著下降；miR-204-5p、miR-497-3p、let-7a-5p表達量均顯著減少，其預測靶基因LC3B、Atg7、Atg4B表達水平均顯著提高。該結果與前人在心肌組織的相關研究結果一致[33-34]。提示10周游泳運動可通過調控miRNAs的變化影響自噬而誘導生理性心肌肥大發(fā)生。

4 結論

10周耐力游泳運動可誘導生理性心肌肥大形成。運動誘導的生理性心肌肥大使心肌細胞自噬水平顯著提高，心肌自噬軸發(fā)生顯著變化可能是通過miRNAs靶向作用于自噬軸相關基因，實現(xiàn)對心肌細胞自噬水平的調控，從而促進運動誘導的生理性心肌肥大形成。