馮 歡，黃小兵，付衛(wèi)華，朱景振，李 佳，楊鳳霞

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科中心，重慶 400037)

尿道狹窄是泌尿外科常見的疾病，傷口創(chuàng)面過度修復(fù)，形成增生性瘢痕，破壞尿道完整性，形成功能性狹窄，是尿道狹窄的誘因之一[1-3]。近年來，創(chuàng)傷性、炎癥性、醫(yī)源性尿道狹窄患者和手術(shù)后復(fù)發(fā)患者數(shù)量顯著增加，術(shù)后2年內(nèi)尿道狹窄的復(fù)發(fā)率為50%～70%[4]。尿道狹窄擴(kuò)張手術(shù)—再狹窄的惡性循環(huán)使得尿道狹窄的臨床治療成為難題[5]。目前，尿道狹窄以藥物治療及尿道內(nèi)切開手術(shù)治療為主，但均存在遠(yuǎn)期療效不佳、容易復(fù)發(fā)的缺點(diǎn)。因此，亟需尋找有效治療尿道狹窄的藥物。

尿道狹窄由尿道瘢痕增生引起，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增生是尿道瘢痕形成的關(guān)鍵因素[6-7]。成纖維細(xì)胞的主要作用是修復(fù)細(xì)胞，該過程受TGF-β調(diào)控[8-9]。尿道成纖維細(xì)胞在正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，在尿道損傷時(shí)經(jīng)TGF-β調(diào)控可進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換?；罨某衫w維細(xì)胞大量增殖，表現(xiàn)出較強(qiáng)的分泌和膠原沉積的能力，致使細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白過度合成和沉積，最終導(dǎo)致尿道瘢痕形成。近年來有研究報(bào)道，法舒地爾在肺纖維化和尿道瘢痕形成中發(fā)揮了重要作用，參與肺成纖維細(xì)胞和尿道瘢痕成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化以及膠原的異常合成[10-11]。本研究擬提取尿道狹窄家兔的原代尿道成纖維細(xì)胞，通過體外培養(yǎng)給藥后，探究法舒地爾對(duì)尿道成纖維細(xì)胞遷移和增殖能力以及胞外基質(zhì)合成的影響，以探索法舒地爾對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的作用，為尿道狹窄的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

10%SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)、α-SMA抗體(Sigma)、Akt抗體(Sigma)、pAKT抗體(Sigma)、mTOR抗體(Sigma)、膠原蛋白Ⅰ抗體(CST)、膠原蛋白Ⅲ抗體(CST)、LC3抗體(CST)、E-鈣黏蛋白抗體(CST)、波形蛋白抗體(CST)、纖維黏連蛋白抗體(CST)、N-鈣黏蛋白抗體(CST)、ATG5抗體(CST)、ATG7抗體(Abcam)、IgG-HRP(Santa Cruz)二抗、DAPI(Beyotime)、侵襲小室(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在無菌條件下獲得家兔體內(nèi)少量的尿道瘢痕組織，將組織標(biāo)本洗滌并浸泡在平衡鹽溶液中，然后切成大小為1 mm×1 mm×1 mm的標(biāo)本[12-13]。將標(biāo)本置于37 ℃、0.1%膠原酶中消化50 min后過濾，組織懸浮液以1 000 r/min離心5 min，在含20%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中復(fù)蘇，獲得原代尿道成纖維細(xì)胞，并采用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。取第3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片、固定、滅活過氧化物酶，按順序滴加血清封閉液、波形蛋白(成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白)Ⅰ抗、Ⅱ抗及ABC復(fù)合物，以DAB顯色，然后脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。成纖維細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 μ/mL、鏈霉素100 μg/mL、丙酮酸10 mmol/L、谷酰胺10 mmol/L、非必需氨基酸20 mmol/L)中于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 小室嵌片置于含2×104/L細(xì)胞的24孔板內(nèi)，10 ng/mL TGF-β或50 μM法舒地爾與10 ng/mL TGF-β共同處理24 h，分為對(duì)照組、TGF-β組和法舒地爾(Fasu) 50 μM+TGF-β組。取出小室內(nèi)庭，用PBS洗滌，4%多聚甲醛固定。內(nèi)庭上部細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色。細(xì)胞遷移數(shù)量用Image J軟件計(jì)算。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 成纖維細(xì)胞按每孔2×103/L接種于96孔板，10 ng/mL TGF-β或50 μM法舒地爾與10 ng/mL TGF-β共同處理24 h，分為對(duì)照組、TGF-β組和Fasu 50 μM+TGF-β組。然后用5 mg/mL MTT溶液10 μL處理4 h，棄去培養(yǎng)液加入二甲基亞砜，并于570 nm處測(cè)量光密度值(OD值)。細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(正常組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 測(cè)量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況時(shí)，成纖維細(xì)胞按每孔5×104/L接種于細(xì)胞皿，用10 ng/mL TGF-β或者聯(lián)合不同濃度(0，25，50 μM)的法舒地爾共同處理24 h，分別設(shè)為對(duì)照組、TGF-β組、Fasu 25 μM+TGF-β組和Fasu 50 μM+TGF-β組。收集細(xì)胞，用冷PBS溶液洗2次，加入300 μL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6、160 mmol/L NaCl、1 mmol/L EGTA、1%脫氧膽酸、1%Triton、0.1%SDS)于冰上裂解5 min后，以12 000 r/min離心30 min，上清液于-80 ℃儲(chǔ)存?？偟鞍子?0%SDS-PAGE凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。分別孵育α-SMA蛋白、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、p62、LC3、ATG5、ATG7(1∶2 000稀釋)，4 ℃過夜，二抗用IgG-HRP室溫孵育1 h。顯影后用Image J軟件計(jì)算蛋白濃度。測(cè)量細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白以及AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白時(shí)，成纖維細(xì)胞按每孔5×104/L接種于細(xì)胞皿，用10 ng/mL TGF-β或者聯(lián)合50 μM法舒地爾共同處理24 h，分別設(shè)為對(duì)照組、TGF-β組、Fasu 50 μM組和Fasu 50 μM+TGF-β組。Western blot操作步驟除一抗孵育環(huán)節(jié)替換為波形蛋白、纖維黏連蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、Akt/PKB、pAKT、mTOR、pmTOR(1∶2 000稀釋)等抗體稀釋液，其余步驟一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 法舒地爾對(duì)成纖維細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示(圖1)，相比于對(duì)照組，TGF-β組的α-SMA蛋白、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ表達(dá)明顯增加(P<0.05)。相比于TGF-β組，其余各組的α-SMA蛋白、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。

a：Western blot電泳圖；b：α-SMA相對(duì)表達(dá)量；c：膠原蛋白Ⅰ相對(duì)表達(dá)量；d：膠原蛋白Ⅲ相對(duì)表達(dá)量 *：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與TGF-β組比較，P<0.05

2.2 法舒地爾對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2a～b)，TGF-β組的細(xì)胞遷移數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，F(xiàn)asu 50 μM+TGF-β組的細(xì)胞遷移數(shù)量顯著低于TGF-β組(P<0.05)。MTT結(jié)果實(shí)驗(yàn)顯示(圖2c)，相比于TGF-β組，對(duì)照組及Fasu 50 μM+TGF-β組的細(xì)胞增殖率顯著較低(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示(圖2d～h)，相比于對(duì)照組，TGF-β組的波形蛋白、纖維黏連蛋白、N-鈣黏蛋白表達(dá)顯著上升，E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);相比于TGF-β組，F(xiàn)asu 50 μM+TGF-β組的波形蛋白、纖維黏連蛋白、N-鈣黏蛋白表達(dá)顯著下降，E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)。

a：細(xì)胞遷移結(jié)晶紫染色圖( ×20)；b:細(xì)胞遷移數(shù)量定量分析；c:細(xì)胞增殖定量分析；d:Western blot電泳圖;e:E-鈣黏蛋白相對(duì)表達(dá)量;f:波形蛋白相對(duì)表達(dá)量:g:纖維黏連蛋白相對(duì)表達(dá)量;h:N-鈣黏蛋白相對(duì)表達(dá)量 *：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與TGF-β組比較，P<0.05

2.3 法舒地爾對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，TGF-β組的pAKT蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),但pmTOR表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與TGF-β組相比，F(xiàn)asu 50 μM+TGF-β組的pAKT和pmTOR蛋白表達(dá)明顯上升P<0.05)，見圖3。

a：Western blot電泳圖；b：pAKT蛋白相對(duì)表達(dá)量；c：pmTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量 *：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與TGF-β組比較，P<0.05

2.4 法舒地爾對(duì)成纖維細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，TGF-β組的ATG7、ATG5、LC3自噬相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，P62蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)；相比于TGF-β組，F(xiàn)asu 25 μM+TGF-β組和Fasu 50 μM+TGF-β組的ATG7、ATG5、LC3自噬相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，P62蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),見圖4。

a：Western blot電泳圖；b：ATG7蛋白相對(duì)表達(dá)量；c：ATG5蛋白相對(duì)表達(dá)量；d：P62蛋白相對(duì)表達(dá)量；e：LC3蛋白相對(duì)表達(dá)量 *：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與TGF-β組比較，P<0.05

3 討論

尿道狹窄是一種慢性創(chuàng)傷性疾病，其特征是尿道內(nèi)纖維組織的形成增加。其病理過程包括創(chuàng)面過度修復(fù)，尿道黏膜及海綿體組織纖維化，尿道腔增生、壓迫或堵塞，最終導(dǎo)致尿道梗阻等功能紊亂[14]。尿道瘢痕狹窄的形成是瘢痕成纖維細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)共同作用的結(jié)果。細(xì)胞外基質(zhì)含有蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)，包括膠原蛋白、彈力蛋白、纖維蛋白、蛋白多糖等，這些生物大分子的無序合成和降解最終導(dǎo)致瘢痕形成[15]。因此，抑制成纖維細(xì)胞的異常生物學(xué)活性和基質(zhì)在瘢痕組織中的過表達(dá)是預(yù)防瘢痕組織增生攣縮的有效途徑。

尿道瘢痕成纖維細(xì)胞是尿道狹窄主要的效應(yīng)細(xì)胞[16]，其增殖和遷移在尿道瘢痕形成中具有重要意義。TGF-β可以誘導(dǎo)纖維細(xì)胞增殖、遷移。除此之外，TGF-β可誘導(dǎo)尿道成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換成肌成纖維細(xì)胞，增加α-SMA蛋白的合成和表達(dá)，α-SMA蛋白和膠原蛋白的過表達(dá)是尿道瘢痕形成的主要原因[17]。α-SMA蛋白組成細(xì)胞骨架基本結(jié)構(gòu)，是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換成肌成纖維細(xì)胞的特殊標(biāo)志。尿道損傷后TGF-β誘導(dǎo)α-SMA蛋白表達(dá)并促進(jìn)其轉(zhuǎn)換[18-19]。同時(shí)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ是胞外基質(zhì)的主要成分。尿道狹窄海綿體由83.9%的膠原蛋白Ⅰ和16.1%的膠原蛋白Ⅲ組成[20]。本研究中TGF-β顯著提高了α-SMA蛋白、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的表達(dá)量，促進(jìn)了細(xì)胞遷移和增殖，與上述研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾的各個(gè)劑量組顯著降低了α-SMA蛋白、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的表達(dá)量，從而抑制了成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，高濃度的法舒地爾明顯抑制了TGF-β刺激下成纖維細(xì)胞的增殖與遷移能力。同時(shí)本研究觀察到經(jīng)法舒地爾處理后，波形蛋白、纖維黏連蛋白、N-鈣黏蛋白表達(dá)顯著下降，E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著上升，提示法舒地爾也抑制了TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換。

自噬是細(xì)胞再利用細(xì)胞內(nèi)組分包括大分子來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的分解代謝通路，近年來發(fā)現(xiàn)，其在纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了極大的作用[21]。AKT/mTOR信號(hào)通路是一個(gè)重要的真核細(xì)胞通路,可以參與到免疫抑制、細(xì)胞增殖、凋亡以及自噬等過程。研究表明，mTOR介導(dǎo)的自噬途徑可以抑制成纖維細(xì)胞增殖，預(yù)防硬膜外纖維化粘連[22]。Kiyono等[23]證明通過調(diào)節(jié)AMPK驅(qū)動(dòng)的AKT/mTOR和TGF-β/SMAD3通路可以緩解異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化。在肝腫瘤細(xì)胞和哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞中TGF-β可以快速刺激細(xì)胞自噬，但具體機(jī)制尚不明確。He等[24]的研究證明TGF-β誘導(dǎo)的纖維形成可以被PI3K/AKT/mTOR介導(dǎo)的自噬抑制。本研究結(jié)果顯示，TGF-β組的pAKT、pmTOR和p62蛋白表達(dá)顯著下降，ATG7、ATG5、LC3等自噬相關(guān)蛋白上調(diào)，提示自噬過程被抑制；而法舒地爾不僅上調(diào)了pAKT、pmTOR、p62等蛋白，抑制了ATG7、ATG5、LC3等自噬相關(guān)蛋白，同時(shí)還抑制了成纖維細(xì)胞的增殖、遷移以及胞外基質(zhì)合成，表明法舒地爾可以通過激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路激活自噬，進(jìn)而抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了法舒地爾可以通過激活A(yù)KT/mTOR介導(dǎo)的自噬從而抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖、遷移以及胞外基質(zhì)合成，提示法舒地爾可能在尿道狹窄中發(fā)揮治療作用。